鏈置換等溫?cái)U(kuò)增-電化學(xué)傳感新技術(shù)聯(lián)用檢測miRNA的方法學(xué)研究.pdf

1、背景:
　　微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的單鏈非編碼RNA，其長度約為19-25個(gè)核苷酸，主要發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用。目前已有研究證明，miRNA參與生命過程中的一系列重要活動，包括生長發(fā)育、免疫防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝、腫瘤發(fā)展、心臟發(fā)生等。雖然目前對已發(fā)現(xiàn)的miRNA分子功能和作用靶基因的研究還處于初步階段，但是從miRNA在不同組織

2、和疾病的表達(dá)譜中分析發(fā)現(xiàn)，某些miRNA在特定疾病中具有明顯的組織特異性。以上研究均表明，miRNA在疾病發(fā)生發(fā)展過程中存在非常重要的作用。miRNA的發(fā)現(xiàn)是臨床分子生物學(xué)革命性的突破，其高度的特異性和穩(wěn)定性決定了其作為一種新的疾病生物標(biāo)志物的巨大潛力。因此，找到一種適合的檢測方法顯得尤為重要。
　　目前，檢測miRNA的常見方法包括印跡雜交、基因芯片、原位雜交以及熒光定量PCR。這些技術(shù)多需要復(fù)雜的步驟、昂貴的儀器以及較高的實(shí)驗(yàn)

3、成本，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。若發(fā)展一種適用于臨床實(shí)驗(yàn)室的miRNA檢測方法，應(yīng)滿足以下幾點(diǎn)要求:一.具備敏感的檢測能力，能定量檢測出極低豐度的不同臨床標(biāo)本中的miRNA;二，具備良好的特異性，能區(qū)分出高度同源的miRNA;三.檢測過程相對簡便，無需昂貴的設(shè)備和試劑。
　　近年新發(fā)展起來的核酸鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，無論是在實(shí)際操作還是儀器要求方面，都比目前常用技術(shù)更為簡單方便，它擺脫了對精良設(shè)備的依賴，在臨床基層和現(xiàn)場快速診斷

4、中均顯示了良好的應(yīng)用前景。鏈置換等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)是指某些具有鏈置換活性的DNA聚合酶在延伸新鏈的過程中遇到下游DNA鏈，可以繼續(xù)延伸并同時(shí)將下游雙鏈剝離而產(chǎn)生游離的單鏈，其不需要特異性識別位點(diǎn)而在miRNA傳感器設(shè)計(jì)中得到廣泛應(yīng)用。然而，目前等溫?cái)U(kuò)增多需要光學(xué)檢測，此過程需要激發(fā)光源，可能會造成背景光的干擾，且熒光在外界環(huán)境易淬滅，再者單一的光學(xué)檢測法本身靈敏度有限，并不適合臨床特別是基層醫(yī)院的廣泛應(yīng)用。如何解決這些不足，成為等溫?cái)U(kuò)增領(lǐng)域的

5、一個(gè)關(guān)鍵問題。
　　生物傳感器由于集高效、靈敏、特異、小巧、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)于一身，目前也已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。與光學(xué)檢測方法相比，電化學(xué)傳感技術(shù)具有易微型化、選擇性好、背景值低、無熒光淬滅、成本低、樣品消耗少、便于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)在核酸檢測方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，且有效彌補(bǔ)了光學(xué)檢測法的不足。然而，傳統(tǒng)的電化學(xué)傳感器多利用信號放大提高靈敏度，由于中間沒有涉及到擴(kuò)增反應(yīng)，多數(shù)方法并不能達(dá)到臨床實(shí)際樣本的檢測要求。如何進(jìn)一步提高靈敏度

6、，成為電化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵問題。
　　綜上所述，鏈置換等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)能夠?qū)怂徇M(jìn)行數(shù)量擴(kuò)增增加方法的靈敏度，電化學(xué)傳感技術(shù)能有效的彌補(bǔ)等溫?cái)U(kuò)增光學(xué)檢測易淬滅背景高等方面的不足，且能通過信號放大進(jìn)一步增加方法的靈敏度?；诖?，我們提出了一個(gè)方案，鏈置換等溫?cái)U(kuò)增與電化學(xué)傳感聯(lián)用檢測miRNA。該方案利用磁性納米粒子作為液相檢測的微載體，通過在微載體上綁定具有莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的探針，當(dāng)體系中的靶miRNA與微載體上的探針結(jié)合后，探針打開

7、。此時(shí)，引物與聚合酶順利連接到探針上，在dNTP存在的條件下發(fā)生延伸反應(yīng)，生物素標(biāo)記的dCTP連接到雙鏈DNA上，而被置換下來的靶miRNA與另一條探針結(jié)合，啟動新一輪循環(huán)。待反應(yīng)一段時(shí)間后，終止等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。隨后，添加鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase，Sa-ALP)，通過磁性分離從而在磁性微粒上標(biāo)記有大量的酶，酶促產(chǎn)物抗壞血酸（L-ascorbic acid，AA）在電極上

8、被氧化為脫氫抗壞血酸，產(chǎn)生可被檢測出的氧化峰電流。
　　目的:
　　鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)聯(lián)用建立一種快速、高效、特異且操作簡單的miRNA檢測方法，并對該方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。完成一定樣本量的組織miRNA檢測并進(jìn)行初步臨床應(yīng)用評價(jià)，為miRNA電化學(xué)檢測提供新思路。
　　方法:
　　1.鏈置換等溫?cái)U(kuò)增-電化學(xué)聯(lián)用體系可行性探討
　　1.1 采用Beacon designer軟件對靶序列（目前暫

9、定miR-21）設(shè)計(jì)特異型莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)探針，瓊脂糖凝膠電泳篩選與靶miRNA標(biāo)準(zhǔn)品特異結(jié)合的探針。
　　1.2 構(gòu)建鏈置換等溫?cái)U(kuò)增體系，測其熒光驗(yàn)證等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)是否能夠順利進(jìn)行。
　　1.3 根據(jù)生物配體的氨羧絡(luò)合反應(yīng)將氨基修飾的寡核苷酸探針（捕獲探針）固定在羧基修飾的磁珠表面，對液相等溫?cái)U(kuò)增體系進(jìn)行共聚焦表征觀察探針是否順利連接到納米磁珠表面。
　　1.4 利用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)對

10、各個(gè)步驟的納米磁珠進(jìn)行表征。
　　1.5 將生物素化的dCTP摻和至等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，探討生物素化dCTP對等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的影響。瓊脂糖凝膠電泳對等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離、鑒定，并選擇理想biotin-dCTP的添加比例。
　　2.基于鏈置換等溫?cái)U(kuò)增/酶促電化學(xué)的miRNA基因傳感器體系構(gòu)建及其方法學(xué)初步評價(jià)
　　2.1 比較不同探針濃度、酶量、稀釋比、孵育時(shí)間等條件下，所產(chǎn)生電信號的變化，優(yōu)化出最佳反應(yīng)條件。
　　2

11、.2 在此反應(yīng)條件下，通過對液相中標(biāo)準(zhǔn)品miRNA的實(shí)時(shí)監(jiān)測，深入解析液相中生物分子反應(yīng)時(shí)傳感器的響應(yīng)機(jī)制，計(jì)算出一系列雜交動力學(xué)常數(shù)，通過傳感器等效電路分析法建立數(shù)學(xué)模型。
　　2.3 驗(yàn)證該基因傳感器鑒定錯(cuò)配的能力。
　　2.4 以目前miRNA檢測常用方法——熒光定量PCR為參考方法，對其進(jìn)行臨床應(yīng)用初步評價(jià)。
　　結(jié)果:
　　1.合成并純化針對miR-21特異序列的氨基修飾的莖環(huán)狀探針，用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)

12、證了其特異性。多功能酶標(biāo)儀熒光圖驗(yàn)證了在phi29DNA聚合酶的參與下鏈置換等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)得以順利進(jìn)行?？瞻状判晕⑤d體(magnetic microcarrier，MMC)與磁性微載體-莖環(huán)狀探針（magnetic microcarrier-molecular beacon，MMC-MB）的激光共聚焦熒光結(jié)果證明了經(jīng)氨羧絡(luò)合反應(yīng)探針能順利連接到磁珠表面。CV結(jié)果表明隨著反應(yīng)的不斷進(jìn)行，納米粒子表面不斷連接上新的物質(zhì)。最后，又通過摻入不同比

13、例的生物素成功驗(yàn)證了生物素?fù)饺敕m影響反應(yīng)速率，但不影響反應(yīng)順利進(jìn)行。
　　2.在本文第一部分成功驗(yàn)證了構(gòu)建方法關(guān)鍵步驟可行性的基礎(chǔ)上，通過條件優(yōu)化測得miRNA電化學(xué)基因傳感體系在miRNA目的序列濃度為10-14M-10-8M范圍內(nèi)，氧化峰電流改變值與miR-21濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，該方法檢測限為9fM，并證實(shí)了其能夠在電化學(xué)平臺上實(shí)現(xiàn)對目的序列的特異性識別，且能夠區(qū)分一個(gè)堿基的差異。最后，利用本方法檢測組織中miR-21的

14、表達(dá)量，其結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果具有良好的一致性，初步驗(yàn)證了該方法的檢測效能。
　　結(jié)論:
　　鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)-酶促反應(yīng)電化學(xué)傳感器聯(lián)用構(gòu)建核酸多酶標(biāo)記體系，分別從數(shù)量擴(kuò)增、放大電流信號兩方面增加分析的靈敏度。該方法不需逆轉(zhuǎn)錄，檢測時(shí)間短，不需大型儀器，適用于臨床特別是基層醫(yī)院廣泛開展。該方法具有較高特異性與靈敏度（檢測限9fM），在低水平miRNA的檢測以及電化學(xué)芯片的研制方面具有一定理論意義和潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。通