電化學(xué)傳感技術(shù)檢測腸道致病菌新方法研究.pdf

1、電化學(xué)傳感器能夠感應(yīng)由待測分析物直接或間接引起的物理、化學(xué)量的變化，并且將這些信息的變化通過換能器轉(zhuǎn)換成電信號來分析待測物。近年來電化學(xué)傳感器與微生物學(xué)、分子生物學(xué)、分析化學(xué)、材料科學(xué)等多學(xué)科相整合，在各個研究領(lǐng)域得到快速的發(fā)展，能夠?qū)Χ喾N物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、無機(jī)離子、藥物、微生物等）進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，使其在臨床檢驗診斷學(xué)和分析科學(xué)中處于一個非?；钴S的研究前言。本課題主要探討電化學(xué)傳感器對腸道致病菌的檢測并建立一系列檢測腸道致病菌新

2、策略和新方法，該方法能夠快速、簡單、靈敏、特異的檢測腸道致病菌，為臨床診斷腸道致病菌感染，食品安全和環(huán)境監(jiān)測提供有力的工具。具體內(nèi)容如下:
　　1.基于核酸適體電化學(xué)傳感器快速靈敏直接檢測腸致病性大腸埃希菌
　　建立一種基于靶細(xì)菌誘導(dǎo)核酸適體被置換的靈敏、特異性的電化學(xué)傳感器來直接檢測EPEC。EPEC特異性核酸適體與金電極上的捕獲探針雜交形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，當(dāng)EPEC存在時，EPEC與雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中的核酸適體結(jié)合，將核酸

3、適體從金電極上捕獲下來，此后加入生物素化的信號探針與金電極上單鏈的捕獲探針雜交，再加入堿性磷酸酶(ST-AP)，在底物中反應(yīng)獲得電化學(xué)信號，電化學(xué)信號與EPEC的濃度成正比。在最優(yōu)的實驗條件下，該傳感器能夠在3.5小時內(nèi)檢測PBS緩沖液和牛奶中的EPEC，對應(yīng)的最低檢測限分別為112 CFU mL-1和305 CFU mL-1。極大提高了常規(guī)檢測EPEC的靈敏度和分析速度，為臨床診斷、食品安全和環(huán)境檢測等領(lǐng)域病原微生物的檢測提供了一個新

4、平臺。
　　2.基于核酸外切酶Ⅲ協(xié)助的信號放大作用的高靈敏電化學(xué)DNA傳感器特異性檢測腸道致病菌。
　　建立一種基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)誘導(dǎo)的靶物質(zhì)循環(huán)信號放大技術(shù)的簡單電化學(xué)DNA傳感器，該傳感器能夠靈敏和特異性的定量腸道桿菌。當(dāng)靶DNA與金電極上的捕獲探針雜交后，ExoⅢ能夠選擇性的水解捕獲探針，而造成靶DNA被釋放出來進(jìn)行新一輪的雜交和水解，最后，金電極上未被水解的捕獲探針與信號探針雜交，結(jié)合于金電極上的信號探針與

5、ST-AP結(jié)合在底物中反應(yīng)產(chǎn)生電化學(xué)信號，該電化學(xué)信號與靶DNA濃度成反比。
　　在最優(yōu)的實驗條件下，本文建立的電化學(xué)傳感器檢測腸桿菌一段特異性的DNA，在DNA濃度為0.01 pM-1 nM內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，并且有較高的靈敏度，最低檢測限可達(dá)8.7 fM。同時將該檢測技術(shù)運用于實際樣本牛奶中腸桿菌的檢測，最低檢測限可定量到40 CFUmL-1。該方法提供一種簡便、快速、廉價、靈敏的檢測手段來定量腸桿菌，對于臨床診斷腸桿菌感

6、染、食品安全、爆發(fā)流行和環(huán)境檢測具有重要意義。
　　3.基于bfpA基因的電化學(xué)DNA傳感器快速高靈敏檢測腸致病性大腸埃希菌
　　建立一種簡單的DNA提取，PCR技術(shù)和電化學(xué)DNA傳感器相結(jié)合的簡單靈敏新方法來檢測EPEC。PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物bfpA基因通過與金電極上的捕獲探針雜交而特異性的被捕獲到金電極上，并且可以進(jìn)一步與信號探針進(jìn)行雜交而形成三明治雜交結(jié)構(gòu)。這種特殊的三明治雜交結(jié)構(gòu)中含有兩個生物素修飾的信號探針，因此電極上

7、大量的生物素化的信號探針可以通過生物素-鏈霉親和素反應(yīng)而結(jié)合大量的ST-Ap，最后在底物中反應(yīng)產(chǎn)生電化學(xué)信號，該電化學(xué)信號的大小與靶細(xì)菌的DNA濃度成正比的關(guān)系。
　　該電化學(xué)DNA傳感器顯示出較高的特異性，可以成功的分辨出互補和錯配的寡核苷酸序列。同時，在最優(yōu)的條件下，本文提出的策略對合成的靶DNA有很高的靈敏度，得到了0.001-10 nM的濃度線性范圍，并且最低檢測限達(dá)到了0.3 pM。此外，該傳感策略可對EPEC進(jìn)行定量檢