電化學傳感技術檢測腸道致病菌新方法研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、電化學傳感器能夠感應由待測分析物直接或間接引起的物理、化學量的變化,并且將這些信息的變化通過換能器轉換成電信號來分析待測物。近年來電化學傳感器與微生物學、分子生物學、分析化學、材料科學等多學科相整合,在各個研究領域得到快速的發(fā)展,能夠對多種物質(蛋白質、核酸、無機離子、藥物、微生物等)進行快速、準確的檢測,使其在臨床檢驗診斷學和分析科學中處于一個非?;钴S的研究前言。本課題主要探討電化學傳感器對腸道致病菌的檢測并建立一系列檢測腸道致病菌新

2、策略和新方法,該方法能夠快速、簡單、靈敏、特異的檢測腸道致病菌,為臨床診斷腸道致病菌感染,食品安全和環(huán)境監(jiān)測提供有力的工具。具體內容如下:
  1.基于核酸適體電化學傳感器快速靈敏直接檢測腸致病性大腸埃希菌
  建立一種基于靶細菌誘導核酸適體被置換的靈敏、特異性的電化學傳感器來直接檢測EPEC。EPEC特異性核酸適體與金電極上的捕獲探針雜交形成雙鏈DNA結構,當EPEC存在時,EPEC與雙鏈DNA結構中的核酸適體結合,將核酸

3、適體從金電極上捕獲下來,此后加入生物素化的信號探針與金電極上單鏈的捕獲探針雜交,再加入堿性磷酸酶(ST-AP),在底物中反應獲得電化學信號,電化學信號與EPEC的濃度成正比。在最優(yōu)的實驗條件下,該傳感器能夠在3.5小時內檢測PBS緩沖液和牛奶中的EPEC,對應的最低檢測限分別為112 CFU mL-1和305 CFU mL-1。極大提高了常規(guī)檢測EPEC的靈敏度和分析速度,為臨床診斷、食品安全和環(huán)境檢測等領域病原微生物的檢測提供了一個新

4、平臺。
  2.基于核酸外切酶Ⅲ協(xié)助的信號放大作用的高靈敏電化學DNA傳感器特異性檢測腸道致病菌。
  建立一種基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)誘導的靶物質循環(huán)信號放大技術的簡單電化學DNA傳感器,該傳感器能夠靈敏和特異性的定量腸道桿菌。當靶DNA與金電極上的捕獲探針雜交后,ExoⅢ能夠選擇性的水解捕獲探針,而造成靶DNA被釋放出來進行新一輪的雜交和水解,最后,金電極上未被水解的捕獲探針與信號探針雜交,結合于金電極上的信號探針與

5、ST-AP結合在底物中反應產生電化學信號,該電化學信號與靶DNA濃度成反比。
  在最優(yōu)的實驗條件下,本文建立的電化學傳感器檢測腸桿菌一段特異性的DNA,在DNA濃度為0.01 pM-1 nM內呈現出良好的線性關系,并且有較高的靈敏度,最低檢測限可達8.7 fM。同時將該檢測技術運用于實際樣本牛奶中腸桿菌的檢測,最低檢測限可定量到40 CFUmL-1。該方法提供一種簡便、快速、廉價、靈敏的檢測手段來定量腸桿菌,對于臨床診斷腸桿菌感

6、染、食品安全、爆發(fā)流行和環(huán)境檢測具有重要意義。
  3.基于bfpA基因的電化學DNA傳感器快速高靈敏檢測腸致病性大腸埃希菌
  建立一種簡單的DNA提取,PCR技術和電化學DNA傳感器相結合的簡單靈敏新方法來檢測EPEC。PCR的擴增產物bfpA基因通過與金電極上的捕獲探針雜交而特異性的被捕獲到金電極上,并且可以進一步與信號探針進行雜交而形成三明治雜交結構。這種特殊的三明治雜交結構中含有兩個生物素修飾的信號探針,因此電極上

7、大量的生物素化的信號探針可以通過生物素-鏈霉親和素反應而結合大量的ST-Ap,最后在底物中反應產生電化學信號,該電化學信號的大小與靶細菌的DNA濃度成正比的關系。
  該電化學DNA傳感器顯示出較高的特異性,可以成功的分辨出互補和錯配的寡核苷酸序列。同時,在最優(yōu)的條件下,本文提出的策略對合成的靶DNA有很高的靈敏度,得到了0.001-10 nM的濃度線性范圍,并且最低檢測限達到了0.3 pM。此外,該傳感策略可對EPEC進行定量檢

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