基于等溫酶擴增反應的免標記化學發(fā)光miRNA檢測新方法.pdf

1、MicroRNAs(miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA,長約19～25個核苷酸(nt)。miRNA是基因表達的重要小分子，多種生理學和病理學的過程都受其調(diào)控，其表達水平與疾病的診斷、分期、預后及治療等密切相關。本論文第一章概述了miRNA檢測新方法的研究進展，隨后闡述了本論文的主要研究內(nèi)容及創(chuàng)新點;第二章將指數(shù)滾環(huán)擴增反應與瞬時衍生化學發(fā)光檢測技術偶合，以鏈霉親合素適配體作為信號分子，實現(xiàn)了let-7a的高靈敏度檢測。詳

2、細優(yōu)化了各項實驗參數(shù)，并比較了模板上有無內(nèi)切酶位點的滾環(huán)擴增以及線性擴增的效率;模板優(yōu)化篩選后發(fā)現(xiàn):采用含有兩個鏈霉親合素適配體互補鏈和一個let-7a的識別序列合計三個酶切位點的模板，能夠?qū)崿F(xiàn)高效率的滾環(huán)信號擴增，得以產(chǎn)生大量的鏈霉親合素適配體序列;隨后采用鏈霉親合索修飾的磁性微球，富集以上的鏈霉親合素適配體序列，利用3，4，5-三甲基苯甲酰甲醛(TMPG)與適配體上G堿基的特異性瞬時化學發(fā)光反應，實現(xiàn)了let-7a的定量檢測，線性范

3、圍為10amol-100 fmol，檢測限可達5 amol。第三章針對let-7家族序列相似度極高、難以識別的特點，將Padlock序列上目標let-7a識別區(qū)域進行單堿基突變，篩選了突變位點，以適度犧牲let-7a信號強度為代價，很好地提高了let-7家族的錯配識別能力，從而建立了一種基于單堿基突變的let-7a高選擇性識別檢測方法。以上方法的構建，為解決miRNA高靈敏度高特異性識別提供了一種可能的途徑，并有望拓寬到其它miRNA或