多孔菌抗腫瘤活性評價及巨多孔菌有效成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定及誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的分子機理研究.pdf

1、多孔菌是屬于擔(dān)子菌亞門的一類大型真菌，它們與子囊菌亞門的一些種共同構(gòu)成了高等真菌藥用活性物質(zhì)的主要來源。為了開發(fā)利用我國的多孔菌資源，本論文對多孔菌進行了以下研究： 1、對浙江、湖南兩省的藥用多孔菌資源進行了調(diào)查、采集、鑒定，并采用MTT法詳細(xì)評價了35種多孔菌對人宮頸癌細(xì)胞株HeLa及人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，所有參試材料的甲醇和水提取物均未顯示細(xì)胞毒性(IC<,50>>100μg/ml)，但有

2、21種多孔菌子實體的石油醚和乙酸乙酯提取物顯示了不同強度的體外抗腫瘤活性(34<50μg/ml)。選定活性最強的巨多孔菌(IC<,50>=34.2μg/ml)作為進一步研究的對象。 2、研究了巨多孔菌的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，巨多孔菌實體的發(fā)生對土壤肥力要求不高，但是與降雨關(guān)系密切；適宜子實體生長的土壤濕度為40％-60％，光照以散射光

3、為宜。對巨多孔菌生物學(xué)特性的了解有助于我們對該種進行引種和馴化。 3、用活性跟蹤分離的方法，對巨多孔菌乙酸乙酯提取物的化學(xué)成分進行了有目的分離，得到一個具較強細(xì)胞毒活性的單體clitocine；另外，還鑒定了clitocine的一個無活性構(gòu)象異構(gòu)體α-clitocine。本研究首次報道的clitocine是巨多孔菌中的主要細(xì)胞毒活性物質(zhì)。a-clitocine首次以天然產(chǎn)物的形式被報道。 4、評價了clitocine的體

4、內(nèi)、外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，clitocine對體外培養(yǎng)的人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌SMMC-7721、人乳腺癌Bcap-37和MCF-7、人胃癌細(xì)胞株SGC-7901均有增殖抑制作用，并具有一定選擇性，對SMMC-7721的抑制作用最強(IC<,50?=1.1μM)，對MCF-7的作用較弱(IC<,50>=43.0μM)。小鼠體內(nèi)抗腫瘤實驗顯示，clitocine對小鼠S180肉瘤沒有顯著抑制作用。首次發(fā)現(xiàn)clitocine對小鼠天

5、然免疫器官一脾臟具有強烈的抑制作用。 5、首次探討了clitocine誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞HeIa死亡的作用機理，獲得了一些有意義的發(fā)現(xiàn)。151xM clitocine作用HeLa細(xì)胞誘導(dǎo)了時間依賴的凋亡；Clitocine誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有典型的凋亡特征，如核形態(tài)的變化，DNA片斷的產(chǎn)生，caspase的激活，PARP裂解，細(xì)胞色素c釋放等；Clitocine處理激活了caspase-3、8、9，在48h內(nèi)caspase家族抑制劑

6、(Z-VAD-FMK)，caspase-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)，caspase-9 inhibitor(Z-LEHD-FMK)均可顯著抑制clitocine誘導(dǎo)的死亡；Clitocine可明顯上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。研究還表明clitocine誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞死亡發(fā)生在細(xì)胞周期各個時期，對周期無阻滯作用。因此，初步認(rèn)為，clitocine誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是由caspase家族和Bcl-2