rmlC反義RNA載體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、目的：結(jié)核病是危害人類健康的最嚴(yán)重的傳染病之一，自20世紀(jì)80年代起，已經(jīng)受到控制的結(jié)核病疫情再次抬頭。主要原因之一是耐多藥的結(jié)核分枝桿菌菌株的日益增加，而現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物不能有效地治愈結(jié)核病，導(dǎo)致結(jié)核病患者的死亡率顯著增加。因此，迫切需要研發(fā)有效的抗結(jié)核新藥。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病的病原體。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁在其生存和增殖過程中起著重要的作用，并且細(xì)胞壁的組

2、成成分和結(jié)構(gòu)比較獨(dú)特，是理想的藥物作用的靶標(biāo)。被分枝菌酸酯化的聚阿拉伯糖與聚半乳糖通過銜接雙糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共價(jià)連接到肽聚糖分子上，以形成分枝桿菌細(xì)胞壁的核心結(jié)構(gòu)。銜接雙糖是一重要的連接結(jié)構(gòu)，破壞這一結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁的完整性將遭到破壞從而結(jié)核分枝桿菌不能生存。銜接雙糖中鼠李糖的糖基供體是dNTP-鼠李糖，四種酶(rmlB，rmlD，rmlA，rmlC)參與了由底物葡萄糖-1-磷酸合成dTDP-鼠李糖的過程，編碼這四種酶的

3、基因存在于結(jié)核分枝桿菌基因組中的不同位置。前期工作中，用基因敲除技術(shù)證明了rmlC是分枝桿菌必需生長(zhǎng)基因。但是，當(dāng)rmlC低表達(dá)時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的合成和細(xì)胞形態(tài)變化的影響還不清楚，需要進(jìn)一步研究。 本論文的目的是構(gòu)建rmlC反義表達(dá)重組質(zhì)粒pMind-rmlC-AS。構(gòu)建pET29b-rmlC表達(dá)重組質(zhì)粒，表達(dá)并純化RmlC蛋白免疫小鼠，制備小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗體。電轉(zhuǎn)化反義表達(dá)重組質(zhì)粒 pMind-rmlC-AS

4、到 Mcycobacterium．smegmatis mc<'2> 155(以下簡(jiǎn)稱mc<'2>155)中，用不同濃度的四環(huán)素(Tetracycline，Tc)誘導(dǎo)其表達(dá)。對(duì)Tc誘導(dǎo)后RmlC蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步研究rmlC基因?qū)u垢分枝桿菌mc<'2>155細(xì)胞壁生長(zhǎng)情況的影響，為抗結(jié)核藥靶標(biāo)選擇提供理論支持。 本論文所獲得的結(jié)果： 1.rmlC反義RNA表達(dá)載體pMind-rmlC-AS的構(gòu)建從TIGR(h

5、ttp：//www．tigr.org/tdb/)的恥垢分枝桿菌me<'2>155基因組數(shù)據(jù)庫獲得Sm rmlC基因的核苷酸序列(606bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分別引入了BarnHI和NdeI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以me<'2>155基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增rmlC基因。將純化的PCR產(chǎn)物與pSTBlue 1連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞中，用限制性內(nèi)切酶Bam

6、HI和Ndel，XbaI鑒定出陽性重組質(zhì)粒，用測(cè)序引物T7 primer對(duì)pSTBlue 1-rmlC中的rmlC片段進(jìn)行DNA宇列測(cè)定，將DNA測(cè)序結(jié)果與已知的rmlC基因進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明所克隆的rmlC DNA片段沒有堿基突變。用限制性內(nèi)切酶BamHI和NdeI酶切pSTBlue I-rmlC，回收與純化rmlC DNA片段后與pMind連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用限制性內(nèi)切酶BamHI和NdeI鑒定出陽性重組

7、質(zhì)粒。 2.表達(dá)載體pET29b-rmlC的構(gòu)建從http：//www．tigr．org/tdb/的數(shù)據(jù)庫中獲得rmlC基因的核苷酸序(606bp)。根據(jù)其核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分別引入了NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以便將rmlC基因克隆到pET29b表達(dá)載體的NdeI和XhoI位點(diǎn)。以mc<'2>155基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增rmlC基因。將純化的rmlC基因與p

8、MD18-T載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue菌株的感受態(tài)細(xì)胞中。用藍(lán)白斑篩選法選出陽性菌落，用限制性內(nèi)切酶XhoI、SacI和XhoⅠ、HindⅢ鑒定出陽性重組質(zhì)粒pMD18-rmlC。用RV-M和M13-47測(cè)序引物對(duì)pMD18-rmlC中的rmlC片段進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果表明所克隆的rmlC基因的核苷酸序列有一個(gè)突變，翻譯成氨基酸后再次進(jìn)行比對(duì)，氨基酸序列完全一致。用NdeI和XhoI雙酶切pMD18-rm

9、lC陽性重組質(zhì)粒，回收并純化rmlC DNA片斷后，與表達(dá)載體pET29b連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaBlue感受念細(xì)胞中。用菌落PCR和NdeI、XhoI雙酶切方法鑒定重組表達(dá)載體pET29b-rmlC，表達(dá)載體中的rmtC基因產(chǎn)物的N端與pET29b載體上的6個(gè)連續(xù)的組氨酸標(biāo)記形成融合蛋白，便于目的蛋白的檢測(cè)和純化。 3．RmlC蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)、純化和鑒定將質(zhì)粒pET29b-rmlC轉(zhuǎn)化

10、到大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，在37℃，用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。超聲破碎誘導(dǎo)的BL21(DE3)，對(duì)上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明RmlC蛋白在BL21(DE3)中表達(dá)。將100ml誘導(dǎo)后的BL21(DE3)大腸桿菌懸浮在5 ml Lysis Prep Buffer中，用超聲方法破碎細(xì)胞后，在4℃離心 12，000g 20分鐘，取上清。加入Ni-NTA柱，用20 ml Lysis Prep

11、Buffer沖洗，再用20 ml Wash Buffer沖洗，除去未于Ni-NTA柱結(jié)合的蛋白。用10 ml的Elute Buffer洗脫，收集前5 ml洗脫液，每個(gè)EP管收集15滴。 樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，用抗多聚組氨酸的單克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，所檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的分子量與預(yù)期的融合蛋白分子量一致，所表達(dá)的蛋白為rmlC基因產(chǎn)物4．抗RmlC蛋白抗體的制備

12、、抗體效價(jià)的測(cè)定及鑒定以純化的重組RmlC蛋白BALB/C小鼠，末次免疫一周后經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血，分離血清56℃滅活30 min，-70℃凍存。采用間接ELISA法測(cè)定效價(jià)，當(dāng)稀釋度為1∶6400時(shí)仍為陽性。用Western印跡鑒定小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗體。結(jié)果表明制備的抗體具有較高的效價(jià)和特異性。 5．rmlC反義RNA在恥垢分枝桿菌mc<'2>155中的表達(dá)電轉(zhuǎn)化pMind-rmlC-AS到mc<'2>155 感受態(tài)細(xì)胞中

13、。分別測(cè)定mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<'2>155菌株在Tc分別為0 ng/ml，10ng/ml，20 ng/ml，50 ng/ml和100 ng/ml條件下的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明，在未達(dá)到48小時(shí)前，mc<'2>155/pMind-rmlC-AS 菌株的生長(zhǎng)速度明顯低于mc<'2>155菌株。當(dāng)Tc濃度為10 ng/ml和20 ng/ml時(shí)，在生長(zhǎng)36小時(shí)時(shí)，兩者菌密度差異最大。 我們分別將100

14、 ml mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<'2>155菌株在Tc濃度為10 ng/ml和20 ng/ml條件下培養(yǎng)36小時(shí)，用超聲方法破碎細(xì)胞后，取上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上，用制備的鼠抗RmlC蛋白多克隆抗體及偶聯(lián)堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在Tc濃度分別為10 ng/ml和20 ng/ml條件下，mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<'2>15

15、5菌株中RmlC蛋白表達(dá)量并無明顯差異。因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化Tc對(duì)mc<'2>155/pMind-rmlC-AS菌株的誘導(dǎo)條件，以產(chǎn)生更多的rmlC反義RNA分子。 結(jié)論：在本研究中，我們以mc<'2>155基因組DNA為模板，用PCR的方法擴(kuò)增出正確的rmlC DNA。構(gòu)建了pMind-rmlC-AS反義表達(dá)載體。構(gòu)建了pET29b-rmlC表達(dá)載體。表達(dá)并純化了RmlC蛋白。用純化的RmlC蛋白免疫BALB/C小鼠，制備了