內含長片段RNA的耐RNase病毒樣顆粒的原核表達載體構建及表達研究.pdf

1、目的：通過構建雙質粒表達系統(tǒng)和單質粒表達系統(tǒng)兩種原核表達系統(tǒng)，并通過應用19 mer莖環(huán)結構的C-變異體和在目的序列中增加包裝位點的數量，探討構建內含大片段嵌合體RNA的耐核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)病毒樣顆粒(Virus-like Particles，VLPs)的可能性。 方法：雙質粒系統(tǒng)表達內含長片段嵌合體RNA的耐核糖核酸酶的VLPs:首先設計含Bam HI和Hind III酶切位點的引物，擴增MS2

2、噬菌體的編碼成熟酶蛋白和衣殼蛋白的1，700 bp序列，Bam HI和Hind III酶切后，與用同樣酶切的表達載體pET-28(b)相連接，得到重組載體pET-MC。應用重疊延伸PCR技術擴增3種病毒的6段嵌合體序列，在設計引物時，使嵌合體兩端含有Fse I和Pac I酶切位點，Fse I和Pac I酶切后，與用同樣酶切的表達載體pACYCDuet-1相連接，得到重組載體pACYC-3V。將雙質粒共轉化入表達菌株BL21-DE3，通過

3、誘導進行表達，將表達后的VLPs純化。應用RT-PCR驗證VLPs是否包裝了全長的RNA片段。然后進行VLPs的穩(wěn)定性試驗和應用HCV RNA國際標準品定值含有嵌合體RNA的VLPs。 單質粒系統(tǒng)表達耐RNase內含長片段嵌合體RNA的VLPs：擴增MS2噬菌體的編碼成熟酶蛋白和衣殼蛋白的1，700 bp序列，并將原來的19 mer的包裝位點序列改變?yōu)镃-變異體，酶切后，與用同樣酶切的表達載體pET-28(b)相連接，得到重組載

4、體pET-MS2-C。應用重疊PCR擴增3種病毒的5段嵌合體序列(3V-five，包括3段SARS-CoV基因、一段HCV基因和一段H5N1基因)，并在SABS-CoV3和HCV序列之間插入一個19 mer的變異體包裝位點序列，在設計引物時，使嵌合體兩端含有Not I酶切位點，與Not I酶切的重組載體pET-MS2-C相連接，構建得到表達載體pET-MS2-3V。同時構建三種對照組表達載體N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C

5、和P-3V-pET-P。通過誘導進行表達。最后分別測定N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-MS2-3V 4種表達產物的260 nm吸光度值(A260)，根據公式lA260=0．125 mg/mL計算4種表達產物的表達效率。 結果：雙質粒系統(tǒng)表達內含長片段嵌合體RNA的耐RNase的VLPs:成功構建了兩種原核表達載體pET-MC和pACYC-3V。經原核表達后得到含全長為2,248 nt

6、的三種病毒6段嵌合體RNA的VLPs;所包裝的RNA具有耐RNase和脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonulcease，DNase)消化的特性以及良好的不同溫度條件下的穩(wěn)定性。VLPs五個濃度(106、105、104、103和102 copies/mL)與國際標準物質的溯源定值結果分別是1.354×107 IU/mL、5.740×105 IU/mL、6.580×104 IU/mL、5.428×103IU/mL和9.613×102 IU

7、/mL。 單質粒系統(tǒng)表達耐RNase內含長片段嵌合體RNA的VLPs：成功構建了4種原核表達載體：pET-MS2-3V、P-3V-pET-P、N-P3V-pET-P和N-P3V-pET-C。pET-MS2-3V和P-3V-pET-P經原核表達后得到含全長為1,891 nt的5段嵌合體RNA的VLPs；N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C其原核表達產物VLPs中僅包裝了1,200 nt的目的嵌合體RNA。N-P3V-pE

8、T-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-MS2-3V的表達效率分別為0.23、0.35、0.35和0.51 mg/mL。N-P3V-pET-C比N-P3V-pET-P表達效率高52％，而pET-MS2-3V比P-3V-pET-P表達效率高38％。 結論：我們構建的表達載體及原核表達系統(tǒng)，可作為構建和制備耐RNase的含三種病毒嵌合體序列的VLPs的平臺，這種VLPs可以作為對同一個標本進行多個病毒的同時檢測