棕色棉色素相關基因RNA干擾載體構建及表達分析.pdf

1、本研究以RT-白絮(白)、棕絮1號(棕)及棕1—61(深棕)為試驗材料,利用化學顯色法及紫外分光光度法對3種材料不同發(fā)育時期纖維色素物質及相對含量變化趨勢進行了研究；利用基因工程方法構建CHS及F3’5’H基因的ihpRNA及amiRNA干擾載體并通過花粉管通道法轉化棕色棉以進行基因功能驗證；以RT-白絮、棕1-61為試驗材料,通過實時熒光定量PCR結果分析類黃酮合成途徑轉錄因子基因CPC、TT8及TTG1基因在不同纖維發(fā)育時期的表達量

2、差異,試圖從分子水平解釋彩色棉纖維品質及色素物質形成的關系。本研究主要結論如下:
　　 1.通過RT-白絮、棕絮1號及棕1-61不同發(fā)育階段纖維及葉、花、蕾甲醇提取液的NaOH、鹽酸.鎂粉顯色反應和紫外光譜掃描,綜合分析以上結果得出結論認為RT-白絮、棕絮1號及棕1-61不同發(fā)育階段未成熟纖維中均含有黃酮醇或二氫黃酮醇,成熟纖維中則不含有；纖維發(fā)育各階段相關色素物質含量比較結果:棕1-61＞棕絮1號＞RT-白絮,其中+28DPA

3、后白色棉與棕色棉色素相關物質含量基本一致,棕1-61+60DPA棉纖維色素相關物質含量高于棕絮1號及RT-白絮；白色棉各時期色素相關物質含量差異較小,棕色棉各時期色素相關物質含暈變化趨勢一致,均在+17DPA達到最大,棕絮1號在+60DPA最低,棕1-61在+28DPA達到最低。
　　 2.利用NCBI公布序列信息,設計特異引物,獲得了查爾酮合成酶基因CHS及類黃酮3’5’羥基化酶基因F3’5’H的mRNA序列全長；利用pHAN

4、NIBAL載體及棉花纖維發(fā)育特異啟動子SCFP,構建了由組成型啟動子CaMV35S及SCFP共同啟動的分別靶向CHS及F3’5’H基因的ihpRNA干擾載體,并通過花粉管通道法進行了遺傳轉化試驗。
　　 3.以棉花microRNA序列Ghr—MIR156d作為骨架,利用micrRNA設計平臺WMD-3(http:／／wmd3.weigelworld.org)設計了靶向CHS及F3’5’5H基因的amiRNA前體序列,并通過與植物

5、表達載體重組連接,構建了靶向CHS及F3’5’H基因的anfiRNA干擾載體,并通過花粉管通道法進行了遺傳轉化試驗。
　　 4.通過實時定量熒光PCR分析了3個不同看家基因.Hitone、Actin及Gbpolyubiquitin在RT-白絮和棕1-61+13、+17、+23、+28DPA纖維樣品中的相對表達量的差異,獲得了適用于在+13DNA至+18DPA纖維基因表達分析的穩(wěn)定內參基因Gbpolyubiquitin基因；

6、>　　 5.通過實時定量熒光PCR分析了3個類黃酮合成途徑轉錄引子基因CPC、TT8及TTG1在RT-白絮和棕1-61+13、+17、+23及+28DPA纖維樣品中的相對表達量差異,CPC及TFG1基因在白色棉纖維發(fā)育各個時期表達量均高于棕色棉,TT8基因在棕色棉纖維發(fā)育各個時期表達量均高于白色棉,結合RT-白絮及棕1-61纖維品質特征,得出結論認為:CPC、TT8及TTG1可能形成類似MYB-bHLH—WD40復合體共同調控天然棕色