重組人HIF-1α反義RNA腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建重組人HIF-1 α反義RNA腺相關(guān)病毒載體(raav-As HIF-1α)，為利用其進(jìn)行抑制膠質(zhì)瘤血管再生及治療研究作準(zhǔn)備。 方法：從膠質(zhì)瘤術(shù)后凍存標(biāo)本或U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中提取總RNA，以RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)兩對(duì)帶有酶切位點(diǎn)引物進(jìn)一步擴(kuò)增出攜帶HIF-1α反義RNA的目的基因片段，酶切后將其在T4連接酶作用下反向與PAAV-Mcs載體連接，再通過(guò)分離濃縮和純化重組腺相關(guān)病毒載體，獲得較高的病毒滴度

2、。 結(jié)果：提取RNA經(jīng)檢驗(yàn)后，通過(guò)RT-PCR獲得HIF-1 α在電泳中可見(jiàn)一條清晰494bp條帶后經(jīng)膠回收得高純度目的基因，將質(zhì)粒及目的基因經(jīng)過(guò)雙酶切后用連接酶連接后轉(zhuǎn)染入XL10大腸桿菌中過(guò)夜可見(jiàn)培養(yǎng)皿中菌落生成，挑克隆經(jīng)腺相關(guān)病毒通用引物PCR擴(kuò)增可見(jiàn)一長(zhǎng)約700bp條帶并經(jīng)測(cè)序鑒定，獲得的目的基因分子序列包含有HIF-1 α反義RNA，且反向插入PAAV-Mcs載體EcoR I，Xhol部位正確，再通過(guò)包裝分離濃縮和純化