疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥對(duì)IBS-D模型大鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本研究為國(guó)家自然科學(xué)基金:疏肝健脾止瀉法對(duì)IBS-D“腦-腸軸異常”的調(diào)控機(jī)制研究(NO.81073160)和廣東省自然科學(xué)基金:疏肝健脾法調(diào)控FBD(-IBS)大鼠“腦-腸軸異常通路”中的差異表達(dá)蛋白特征性研究(NO.1015104701000041)的部分研究?jī)?nèi)容。課題組前期建立了具有內(nèi)臟超敏化、腹瀉癥狀明顯的IBS-D大鼠模型，并開(kāi)發(fā)研制了具有疏肝健脾、清熱利濕、止瀉、止痛功效的腸激安膠囊(專(zhuān)利號(hào):ZL201110075802.5

2、)，初步分析了疏肝健脾止瀉法在IBS-D“腦-腸軸異?！敝械淖饔脵C(jī)制。
　　本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善IBS-D模型大鼠的造模方法和評(píng)價(jià)體系，并對(duì)其中醫(yī)證候?qū)傩赃M(jìn)行分析;考察疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥腸激安膠囊對(duì)IBS-D神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)控作用。
　　第一部分:肝郁脾虛型IBS-D動(dòng)物模型建立和評(píng)價(jià)體系的完善
　　目的:
　　參考國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)中關(guān)于IBS-D的造模方法，建立一種病-證-癥結(jié)合的IBS

3、-D動(dòng)物模型，并完善其評(píng)價(jià)體系，判斷其中醫(yī)證候?qū)傩浴?br>　　方法:
　　(1)以“腹瀉型腸易激綜合征”、“IBS-D”、“動(dòng)物模型”等為檢索詞，查找相關(guān)文獻(xiàn)，并進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)、數(shù)據(jù)提取和分析，考察國(guó)內(nèi)外IBS-D模型動(dòng)物種屬和性別選擇情況及模型建立方法，篩選最佳的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、動(dòng)物性別和造模方法;
　　(2)在前期研究基礎(chǔ)上，以母嬰分離、束縛應(yīng)激和直腸醋酸刺激三因素聯(lián)合建立IBS-D大鼠模型，以Bristol分型積分和糞便

4、含水量、內(nèi)臟敏感性和腸組織形態(tài)評(píng)價(jià)其病癥特點(diǎn)，以一般行為學(xué)評(píng)分、糖水偏好百分比、懸尾不動(dòng)時(shí)間、日均進(jìn)食量、脾系數(shù)和胸腺系數(shù)評(píng)價(jià)其證候特征;
　　(3)根據(jù)“以方測(cè)證”原理，將成功的IBS-D模型隨機(jī)分為四逆散組、痛瀉要方組、腸激安方組和模型對(duì)照組，另取正常大鼠作為空白對(duì)照，分別采用四逆散、痛瀉要方和腸激安膠囊對(duì)IBS-D模型大鼠進(jìn)行干預(yù)和治療，模型對(duì)照組和正常組同法給予生理鹽水，考察一般行為學(xué)評(píng)分、糖水偏好百分比、懸尾不動(dòng)時(shí)間、日

5、均進(jìn)食量、脾系數(shù)和胸腺系數(shù)等指標(biāo)的變化差異，判斷所建立的IBS-D模型大鼠的中醫(yī)證候?qū)傩浴?br>　　結(jié)果:
　　(1)國(guó)內(nèi)外研究中，建立IBS-D動(dòng)物模型的研究對(duì)象以SD雄性乳鼠最優(yōu)，宜優(yōu)先選擇化學(xué)試劑刺激、束縛應(yīng)激結(jié)合母嬰分離法復(fù)合造模;
　　(2)所建立的新模型組和原模型組IBS-D大鼠的糞便Bristol分型積分、糞便含水量較正常組均顯著升高（aP＜0.05），且新模型組造模結(jié)束后10天糞便積分值和含水量均顯著高于原

6、模型組（bP＜0.05），造模結(jié)束10天波動(dòng)較小;而腸道敏感性均較正常組顯著降低(aP＜0.05)，脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)顯著增加（aP＜0.05），且新模型組和原模型組之間無(wú)顯著差異(bP＞0.05);正常組、新模型組和原模型組大鼠的回腸、直腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)異常病變，而新模型組和原模型組大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)輕微充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);新模型組和原模型組大鼠的行為學(xué)綜合得分、日均進(jìn)食量和糖水偏好百分比較正常組顯著降低（aP＜0.05），懸

7、尾不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（aP＜0.05）;而與原模型組比較，新模型組的行為學(xué)綜合得分值顯著下降(bP＜0.05)，糖水偏好百分比顯著升高(bP＜0.05)，懸尾不動(dòng)時(shí)間和日均進(jìn)食量無(wú)顯著差異(bP＞0.05);
　　(3)給予四逆散后，IBS-D大鼠行為學(xué)綜合得分、日均進(jìn)食量、糖水偏好百分比均顯著增加(bP＜0.05)，懸尾不動(dòng)時(shí)間和胸腺系數(shù)均顯著降低(bP＜0.05);給予痛瀉要方后，IBS-D大鼠行為學(xué)綜合得分、日均進(jìn)食量均顯著增

8、加(bP＜0.05)，懸尾不動(dòng)時(shí)間和胸腺系數(shù)均顯著降低(bP＜0.05)，糖水偏好百分比無(wú)顯著差異（bP＞0.05）;給予腸激安膠囊后，IBS-D大鼠行為學(xué)綜合得分、日均進(jìn)食量、糖水偏好百分比均顯著增加(bP＜0.05)，懸尾不動(dòng)時(shí)間和胸腺系數(shù)均顯著降低(bP＜0.05);所有干預(yù)方藥均對(duì)脾臟系數(shù)無(wú)顯著影響(bP＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)采用早期母嬰分離、束縛應(yīng)激和直腸醋酸刺激法可建立IBS-D大鼠模型，且該模型

9、屬于中醫(yī)肝郁脾虛證候范疇;
　　(2)所建立的IBS-D模型具有內(nèi)臟敏感性升高、腹瀉、抑郁、免疫功能亢進(jìn)的特點(diǎn)，且其結(jié)腸組織存在低度炎癥;
　　(3)Bristol糞便分型積分和內(nèi)臟敏感性可作為判斷該模型是否成功的重要依據(jù)。
　　第二部分:疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥干預(yù)IBS-D大鼠氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)機(jī)理研究
　　目的:
　　建立微透析在體采樣-高效液相(high-performance liquid chroma

10、tography, HPLC)聯(lián)用測(cè)定腦局部氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的方法，并探討興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，Glu)和抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，γ-GABA)在IBS-D中的發(fā)病機(jī)制及疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥干預(yù)IBS-D的作用機(jī)理。
　　方法:
　　(1)以C18色譜柱，甲醇-0.1mol/L醋酸鈉緩沖液(pH=6.9)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫25℃;激發(fā)波

11、長(zhǎng)λex=357nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=455nm，進(jìn)樣量10μL為色譜條件，建立氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)OPA衍生-熒光高效液相色譜含量測(cè)定方法;
　　(2)以微透析探針的體外相對(duì)回收率和穩(wěn)定性為指標(biāo)，篩選最佳的灌流速度、灌流液溫度、樣品濃度，并以體內(nèi)相對(duì)損失率及其穩(wěn)定性為指標(biāo)，對(duì)所建立的微透析采樣技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證和校正;
　　(3)將IBS-D模型大鼠隨機(jī)分為腸激安高、中、低劑量組、匹維溴銨組和模型對(duì)照組，另取正常大鼠作為空白對(duì)照，分

12、別給予相應(yīng)藥物干預(yù)治療，采用活體腦微透析采樣-HPLC聯(lián)用技術(shù)測(cè)定各組大鼠給藥后第1、3、7、11、14、21、28天的腦內(nèi)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量。
　　結(jié)果:
　　(1)Asp、Glu、Tau和γ-GABA的峰形完整，分離度良好，精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均符合方法學(xué)測(cè)定要求;
　　(2)Glu和γ-GABA最佳的微透析實(shí)驗(yàn)條件為以37℃人工腦脊液作為灌流液，灌流速度為0.8μL/min，采樣間隔為30min;其腦微透析校

13、正值分別為0.3439和0.2732;
　　(3)與空白對(duì)照組比較，IBS-D大鼠海馬組織中γ-GABA的含量顯著升高(aP＜0.05)，給予腸激安膠囊和匹維溴銨后其含量顯著下降(bP＜0.05)，且腸激安膠囊存在一定的濃度依賴(lài)性;Glu的含量也顯著升高（aP＜0.05），給予腸激安膠囊其含量顯著下降（bP＜0.05），但給予匹維溴銨其含量無(wú)明顯變化(bP＞0.05);而Glu/γ-GABA水平顯著低于空白對(duì)照組(aP＜0.05)

14、，給予高劑量和中劑量腸激安膠囊后，其水平呈持續(xù)升高趨勢(shì)(bP＜0.05)，并逐漸恢復(fù)至正常水平（aP＞0.05），低劑量腸激安膠囊對(duì)該平衡無(wú)明顯的影響((▲)P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸Glu和抑制性氨基酸γ-GABA的比例失調(diào)可能是IBS-D發(fā)生的重要機(jī)制之一，其表現(xiàn)該平衡向抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)方向偏移，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)抑郁狀態(tài);疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥干預(yù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Glu/γ

15、-GABA水平使之恢復(fù)平衡狀態(tài)有關(guān)。
　　第三部分:疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥對(duì)IBS-D大鼠的內(nèi)分泌及體液調(diào)節(jié)機(jī)制研究
　　目的:
　　探討內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的激素5-HT、DA、ACTH、CORT及5-HT3受體、CCK-8和體液相關(guān)的電解質(zhì)Na+、Ca2+、K+和Cl-在IBS-D發(fā)病中的機(jī)制及疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥對(duì)上述指標(biāo)的影響。
　　方法:
　　(1)以肝郁脾虛型IBS-D大鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)分為腸激安高、

16、中、低劑量組、匹維溴銨組和模型對(duì)照組，另取正常大鼠作為空白對(duì)照，給予相應(yīng)藥物干預(yù)后，采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中5-HT、DA、ACTH和CORT的含量，采用離子選擇性電極法測(cè)定Na+，采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測(cè)定Ca2+，采用比濁法測(cè)定K+、Cl-的含量。
　　(2)剝離各組大鼠海馬組織和結(jié)腸組織，采用免疫組織化學(xué)染色法，觀察5-HT3受體和CCK-8陽(yáng)性表達(dá)情況，并用MetaMorph圖像分析軟件測(cè)定其光密度值(IOD)

17、，并對(duì)海馬-結(jié)腸組織的IOD值進(jìn)行線性分析。
　　結(jié)果:
　　(1)與空白對(duì)照組比較，IBS-D模型大鼠血清中5-HT、DA、ACTH和CORT含量均顯著升高(aP＜0.05)，給予高、中劑量腸激安膠囊和匹維溴銨后，血清中5-HT、DA、ACTH和CORT含量均顯著下降(bP＜0.05)，而低劑量腸激安膠囊對(duì)5-HT、ACTH和CORT無(wú)明顯影響(bP＞0.05)，能顯著下調(diào)DA的釋放(bP＜0.05);與空白對(duì)照組比較，I

18、BS-D模型大鼠血清中Na+、Ca2+和K+含量均顯著降低（aP＜0.05），Cl-的含量無(wú)明顯變化（aP＞0.05）;IBS-D模型大鼠給予高、中劑量腸激安膠囊后，血清中Na+、K+和Cl-的含量均顯著升高(bP＜0.05)，低劑量腸激安膠囊可顯著提高K+和Cl-的含量(bP＜0.05)，而匹維溴銨對(duì)IBS-D大鼠血清中Na+和Cl-的含量無(wú)影響(bP＞0.05)，腸激安膠囊對(duì)血清Ca2+含量無(wú)影響（bP＞0.05）;
　　(2

19、)所有切片中均可見(jiàn)5-HT3受體、CCK-8陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，胞漿中可見(jiàn)黃色或棕黃色顆粒。各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)完整，未見(jiàn)異常病變，而模型組海馬組織細(xì)胞核固縮，濃染，出現(xiàn)核偏位，結(jié)構(gòu)層次模糊;給予高、中、低劑量腸激安膠囊后結(jié)構(gòu)層次恢復(fù)清晰可見(jiàn);給予匹維溴銨后海馬組織層次無(wú)好轉(zhuǎn);
　　(3)與空白對(duì)照組比較，IBS-D模型大鼠結(jié)腸組織和海馬組織中5-HT3受體平均光密度值均顯著增加（aP＜0.05），給予高、中、低劑量腸激安膠囊后，5-

20、HT3受體平均光密度顯著下降(bP＜0.05)，且存在一定的濃度依賴(lài)性;給予匹維溴銨后結(jié)腸組織中5-HT3受體平均光密度顯著下降，但海馬組織中5-HT3受體平均光密度反而升高;空白對(duì)照組大鼠海馬組織和結(jié)腸組織中5-HT3受體平均光密度存在高度的相關(guān)性（r=0.9047，P=0.000＜0.05）;而模型組大鼠海馬組織和結(jié)腸組織中5-HT3受體平均光密度無(wú)明顯的相關(guān)性(P=0.123＞0.05);給予高、中劑量腸激安膠囊后，IBS-D大鼠

21、海馬組織和結(jié)腸組織中5-HT3受體平均光密度存在高度的相關(guān)性(r=0.8722，P=0.001＜0.05; r=0.8140，P=0.004＜0.05);給予低劑量腸激安膠囊和匹維溴銨后，IBS-D大鼠海馬組織和結(jié)腸組織中5-HT3受體平均光密度無(wú)明顯的相關(guān)性(P=0.183＞0.05;P=0.164＞0.05);各組大鼠結(jié)腸組織和海馬組織中CCK-8的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，且無(wú)明顯的線性關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　(

22、1)所建立的IBS-D模型大鼠呈現(xiàn)出內(nèi)分泌失調(diào)和電解質(zhì)紊亂的狀態(tài)，而疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥能通過(guò)下調(diào)血清中5-HT、DA、ACTH和CORT含量，增加K+、Na+含量，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而達(dá)到改善IBS-D癥狀的目的;
　　(2)5-HT3受體表達(dá)量的增加可能是引起IBS-D內(nèi)臟痛閾值降低、敏感性升高的重要原因之一，疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥干預(yù)IBS-D的作用機(jī)制可能是用過(guò)下調(diào)模IBS-D模型大鼠海馬和結(jié)腸組織中5-HT3受體表達(dá)水平，

23、減少其與5-HT的結(jié)合，減弱神經(jīng)元的興奮性，從而提高內(nèi)臟痛閾值，消除腸道的高敏感性。
　　第四部分:疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥對(duì)IBS-D大鼠免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)理研究
　　目的:
　　探討Th1/Th2細(xì)胞漂移在IBS-D中的發(fā)病機(jī)制，疏肝健脾止瀉復(fù)方中藥對(duì)Th1細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10含量及IFN-γ及IL-4 mRNA表達(dá)水平的影響。
　　方法:
　　(1)以肝郁脾虛型I

24、BS-D大鼠為研究對(duì)象，隨機(jī)分為腸激安高、中、低劑量組、匹維溴銨組和模型對(duì)照組，另取正常大鼠作為空白對(duì)照，給予相應(yīng)藥物干預(yù)后，取海馬組織和結(jié)腸組織，處理后采用放射免疫法檢測(cè)其組織中Th1細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10含量;
　　(2)提取海馬組織和結(jié)腸組織中總RNA，并鑒定其濃度和純度，采用嵌合熒光法RT-PCR擴(kuò)增后檢測(cè)其IFN-γ及IL-4 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　與空

25、白對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸Th1細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ均顯著升高（aP＜0.05），而Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10均顯著降低（aP＜0.05），且IFN-γ/IL-4值顯著升高（aP＜0.05）;給予高、中劑量腸激安膠囊后，Th1細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ均顯著降低(bP＜0.05)，而Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10均顯著升高(bP＜0.05)，且高劑量組IFN-γ/IL-4值顯著升高（bP＜0.05）恢復(fù)至接近正常

26、水平（aP＞0.05），均顯著高于匹維溴銨組（cP＜0.05）;與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織Th1細(xì)胞因子IL-2的含量顯著降低（aP＜0.05），IFN-γ的含量顯著升高（aP＜0.05），而Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10均顯著降低（P＜0.05），且IFN-γ/IL-4值顯著升高（aP＜0.05），給予高、中劑量腸激安膠囊后，Th1細(xì)胞因子IL-2含量顯著升高（bP＜0.05），IFN-γ含量顯著降低（bP＜0.05），

27、而Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10均顯著升高(bP＜0.05)，且高劑量組IFN-γ/IL-4值顯著降低(bP＜0.05)恢復(fù)至接近正常水平（P＞0.05）;RT-PCR結(jié)果顯示，IL-4 mRNA在模型組大鼠海馬組織和結(jié)腸組織中的表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組，IFN-γ mRNA在模型組的表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組，給予腸激安膠囊后，能顯著降低IFN-γmRNA的表達(dá)水平，提高IL-4mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　Th