基于BDNF-JAK2-STAT3-GABAAR通路探討疏肝健脾方對肝郁脾虛IBS-D大鼠的作用機制.pdf

1、目的
　　腹瀉型腸易激綜合征（Irritable Bowel Syndrome-Diarrhea，IBS-D）是一種慢性功能性腸病，屬中醫(yī)泄瀉、郁證等病癥范疇，主要癥狀表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹脹、腹痛、腹瀉，其誘發(fā)因素包括社會環(huán)境、心理、腸道、遺傳等，中醫(yī)認為肝郁脾虛泄瀉是其主要病機，最常見的證型是肝郁脾虛型，患者多伴有焦慮抑郁等精神異常狀態(tài)，臨床上也常見抗抑郁藥輔助治療IBS-D。疏肝健脾代表方—腸激安方為治療IBS-D的臨床驗方，從

2、肝脾論治，同時改善腸道癥狀及調(diào)暢情志，療效確切。課題組前期采用母嬰分離+醋酸刺激+束縛應(yīng)激三因素結(jié)合的方法成功建立了肝郁脾虛型IBS-D大鼠模型，腸激安方可改善其內(nèi)臟高敏感性、腹瀉癥狀，調(diào)控肥大細胞顆粒、CD4+/CD8+、5-HT、NPY、GABA等神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)相關(guān)因子。BDNF在多種精神疾病如焦慮、抑郁中有重要作用，有研究報道IBS-D患者結(jié)腸黏膜活檢標本中BDNF高表達，與腹痛嚴重程度有良好的相關(guān)性;也有研究報道BDNF

3、可通過JAK/STAT通路調(diào)控GABAARα1，但BDNF及相關(guān)因子在IBS-D中的作用機制尚不明確。因此，本論文針對腸激安方對肝郁脾虛型IBS-D大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的作用，擬通過動物實驗和細胞實驗的相互驗證，進一步探討疏肝健脾方對肝郁脾虛型IBS-D大鼠的作用機制。
　　動物實驗方面:
　　(1)探討肝郁脾虛IBS-D大鼠焦慮-抑郁樣行為、海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元的變化，以及腸激安方的作用。
　　(2)觀察腸激安方

4、對IBS-D大鼠血清、海馬、結(jié)腸組織中BDNF蛋白與mRNA表達的影響。
　　(3)觀察腸激安方對IBS-D大鼠海馬GABAARα1、GABAARα2、TrkB、CREB mRNA表達的影響。
　　(4)觀察腸激安方對IBS-D大鼠海馬JAK2/STAT3信號通路的調(diào)控作用，探討腸激安方通過BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路改善肝郁脾虛型IBS-D大鼠癥狀的作用機制。
　　細胞實驗方面:
　　(1)

5、篩選皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷PC12細胞的條件。
　　(2)探討腸激安方對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷的PC12細胞模型中BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的干預(yù)作用。
　　方法
　　一、疏肝健脾方對肝郁脾虛型IBS-D大鼠BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的調(diào)控作用
　　(1)采用母嬰分離+醋酸刺激+束縛應(yīng)激三因素結(jié)合的方法制備肝郁脾虛型IBS-D大鼠模型;造模成功后將大鼠隨機分為模型對照組、匹維溴銨組(0

6、.018 g·kg-1)、腸激安方高劑量組（33.48 g·kg-1）、腸激安方低劑量組(16.74 g·kg-1)，另取同批次正常大鼠做為正常對照組，各6只，連續(xù)灌胃14d，正常組和模型組給予等體積生理鹽水。給藥結(jié)束后進行糖水偏好試驗以及曠場試驗檢測IBS-D大鼠的焦慮-抑郁樣行為，HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。
　　(2)造模給藥后取各組大鼠血清、海馬、結(jié)腸組織，ELISA法檢測各組大鼠血清中BDNF的含量，Q-PCR、免疫

7、組化、Western Blot法分別檢測海馬、結(jié)腸中BDNF的基因、蛋白表達
　　(3)造模給藥后取各組大鼠海馬組織，Q-PCR檢測海馬中GAB AARα1、GABAARα2、TrkB、CREB mRNA表達。
　　(4)造模給藥后取各組大鼠海馬組織，Q-PCR檢測海馬中JAK2、STAT3、TNF-α、IL6的基因表達，免疫組化檢測STAT3蛋白原位表達，Western Blot法分別檢測JAK2、STAT3、pSTAT3

8、蛋白表達。
　　二、疏肝健脾方對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷PC12細胞模型BDNF/J AK2/STAT3/GAB AAR通路的調(diào)控作用
　　(1)培養(yǎng)PC12細胞，采用CCK8法檢測不同接種密度、培養(yǎng)時間以及皮質(zhì)酮濃度對PC12細胞增殖的影響，并結(jié)合顯微鏡觀察細胞的生長形態(tài)。
　　(2) CCK8法篩選出腸激安方干預(yù)PC12細胞的合適濃度，分為高(5.0mg/ml)、中(2.5mg/ml)、低劑量（1.25 mg/ml）組進行干

9、預(yù)皮質(zhì)酮（200μM）誘導(dǎo)損傷的PC12細胞模型，采用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)游離Ca2+濃度，酶標儀檢測細胞分泌NO濃度，Q-PCR法考察BDNF、JAK2、STAT3、TrkB、CREB、GABAARα1、GABAARα2的基因表達;Western Blot法分別檢測BDNF、JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達。
　　結(jié)果
　　一、疏肝健脾方對肝郁脾虛型IBS-D大鼠BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的

10、調(diào)控作用
　　(1)和正常對照組相比，模型對照組糖水偏好值明顯降低(P＜0.05)，曠場實驗水平運動、垂直運動得分以及中央格停留時間明顯減少（P＜0.05），腸激安方高劑量、低劑量組的糖水偏好值、曠場實驗水平運動、垂直運動得分以及中央格停留時間均明顯升高（P＜0.05），匹維溴銨組糖水偏好值、曠場實驗水平運動、垂直運動得分以及中央格停留時間呈上升趨勢，但只有垂直運動得分有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)細胞層

11、次結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊緊密，大小一致，細胞結(jié)構(gòu)清晰，胞核圓形或橢圓形，模型對照組大鼠海馬CA1細胞層次稍紊亂，排列不甚規(guī)則，各給藥組有所改善。各組大鼠海馬CA3區(qū)、DG區(qū)細胞形態(tài)無明顯差異，細胞排列整齊緊密，層次清晰，細胞呈圓形或橢圓形，核仁清晰可見，染色質(zhì)分布均勻。
　　(2)與正常對照組比較，IBS-D模型大鼠血清中BDNF含量明顯減少(P＜0.05)，給予藥物治療后，各給藥組大鼠血清BDNF含量與模型對照組比較明顯升高（P＜0

12、.05)，與正常對照組比較無明顯差異（P＞0.05）。與正常對照組比較，IBS-D模型大鼠海馬、結(jié)腸組織中BDNF mRNA表達明顯升高(P＜0.05)，給予藥物治療后，各給藥組大鼠海馬、結(jié)腸組織中BDNF mRNA的表達與模型對照組比較明顯下降(P＜0.05)。與正常對照組比較，IBS-D模型大鼠海馬、結(jié)腸組織中BDNF蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，給予藥物治療后，腸激安高、低劑量組大鼠海馬、結(jié)腸組織中BDNF蛋白表達與模型對照組

13、比較明顯減少(P＜0.05)，匹維溴銨組大鼠結(jié)腸組織中BDNF蛋白表達與模型對照組比較顯著減少（P＜0.05），而海馬中BDNF蛋白表達含量減少，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(3)和正常組相比，IBS-D模型大鼠海馬中GABAARα1、GABAARα2、CREBmRNA表達減少(P＜0.05)，TrkB mRNA表達明顯增加(P＜0.05);給予藥物治療后，腸激安方高劑量組GABAARα1、GABAARα2、CREB m

14、RNA相對表達量較模型組升高(P＜0.05)，TrkB mRNA相對表達量較模型組降低（P＜0.05）;腸激安方低劑量組CREB、TrkB mRNA相對表達量較模型組分別升高、降低（P＜0.05），GABAARα1、GABAARα2 mRNA相對表達量有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);而匹維溴銨組GABAARα1、GABAARα2、CREB mRNA相對表達量較模型組升高（P＜0.05），TrkBmRNA相對表達量較模型組降低

15、(P＜0.05)。
　　(4)與正常對照組比較，IBS-D模型大鼠海馬中JAK2、STAT3、TNF-α mRNA表達明顯增加（P＜0.05），IL6雖有上升的趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);而給予藥物治療后，腸激安方高劑量組JAK2、STAT3、TNF-α mRNA相對表達量較模型組減少（P＜0.05）;腸激安方低劑量組STAT3、TNF-α mRNA相對表達量較模型組減少(P＜0.05)，JAK2 mRNA有減少的趨勢

16、，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。匹維溴銨組STAT3mRNA相對表達量較模型組減少（P＜0.05），TNF-α、JAK2 mRNA有減少的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與正常對照組比較，IBS-D模型大鼠海馬JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達明顯增加(P＜0.05);與模型對照組比較，腸激安方高劑量組大鼠海馬JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達減少(P＜0.05)，腸激安方低劑量組大鼠海馬JAK2、STAT3蛋白

17、表達減少(P＜0.05)，pSTAT3蛋白表達也減少但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);匹維溴銨組大鼠海馬中JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達量也均相對減少，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）
　　二、疏肝健脾方對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷PC12細胞模型BDNF/JAK2/STAT3/GABAAR通路的調(diào)控作用
　　(1)接種密度為1×105/ml的PC12細胞在72h內(nèi)生長狀態(tài)正常;400μM的皮質(zhì)酮對PC12細胞增殖的抑制率約61

18、.61％(P＜0.05)，細胞大部分收縮漂浮;300μM、250μM的皮質(zhì)酮對PC12細胞增殖的抑制率分別為48.58％、49.58％(P＜0.05)，有較多的細胞收縮漂浮;200μM的皮質(zhì)酮對PC12細胞增殖的抑制率為36.41％(P＜0.05)，收縮漂浮的細胞較少，大部分細胞呈梭狀，突觸明顯。100μM的皮質(zhì)酮對PC12細胞增殖的抑制率為15.33％（P＞0.05），大部分細胞呈梭狀，突觸明顯，個別細胞收縮漂浮。
　　(2)皮

19、質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷PC12細胞后，細胞內(nèi)游離Ca2+濃度以及NO分泌均明顯增加(P＜0.05)，而腸激安方高、中、低劑量均能減少Ca2+濃度以及NO分泌(P＜0.05)。模型組細胞BDNF、TrkB、JAK2、STAT3 mRNA表達增加，GABAARα1、GABAARα2mRNA表達減少，CREB mRNA無明顯變化(P＞0.05);與模型組比較，腸激安高劑量組BDNF、TrkB、JAK2、STAT3 mRNA表達減少(P＜0.05)，GA

20、BAARα1、GABAARα2mRNA表達增加(P＜0.05)，中劑量組TrkB、JAK2、STAT3 mRNA表達減少(P＜0.05)，GABAARα1、GABAARα2 mRNA表達增加(P＜0.05)，低劑量組TrkB、JAK2、STAT3 mRNA表達減少（P＜0.05），GABAARα1 mRNA表達增加（P＜0.05）;與正常對照組比較，模型組BDNF、JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達明顯增加(P＜0.05);與模

21、型對照組比較，腸激安方高、中、低劑量組BDNF、JAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達均減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　(1)“三因素”法制備的肝郁脾虛IBS-D大鼠有明顯焦慮-抑郁樣行為，但海馬神經(jīng)元無明顯形態(tài)變化，腸激安方可明顯改善IBS-D焦慮-抑郁樣行為。BDNF在肝郁脾虛型IBS-D血清、海馬、結(jié)腸均異常表達，而腸激安方可上調(diào)血清中BDNF的表達水平，下調(diào)結(jié)腸、海馬中BDNF的表達水平;同時腸激安方還可上

22、調(diào)肝郁脾虛型IBS-D大鼠海馬中GABAARα1、GABAARα2、CREB mRNA表達水平，下調(diào)TrkB mRNA表達水平;在IBS-D大鼠海馬中JAK2/STAT3通路被激活，腸激安方可抑制該信號通路的活性。下調(diào)海馬中BDNF水平，抑制JAK2/STAT3通路活性，增加GABAARα1、GABAARα2的表達，這可能也是腸激安方對IBS-D的作用機制。
　　(2)腸激安方可抑制皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷PC12細胞胞內(nèi)Ca2+濃度升高及