AKT-mTOR-NF-κB增加CXCR4促進(jìn)大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞損傷修復(fù)研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary hypertension，PH）是多種病因?qū)е碌囊淮箢惣膊?，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈壓力升高和肺血管阻力增高，進(jìn)一步發(fā)展至右心衰竭，最終導(dǎo)致死亡。低氧是PH發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要原因，所以低氧性肺動(dòng)脈高壓（ Hypoxic pulmonary hypertension，HPH）的發(fā)病機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。HPH特征性病理表現(xiàn)為肺血管平滑肌細(xì)胞增殖和肺血管重構(gòu)。研究肺血管重構(gòu)的分子機(jī)制，找出能夠抑制和逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)發(fā)生

2、的關(guān)鍵分子通路，進(jìn)而從根本上防治HPH的發(fā)生和發(fā)展是本課題的研究重點(diǎn)。
　　低氧性肺動(dòng)脈高壓的肺組織中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路顯著活化，提示該信號(hào)通路在HPH中發(fā)揮了重要作用；文獻(xiàn)報(bào)道HPH的肺組織中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB顯著活化，CXC趨化因子受體-4（CXCChemokinereceptor-4，CXCR4）的表達(dá)顯著升高。本課題重點(diǎn)闡述PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與NF-κB活化以及CXCR4高表達(dá)之間的內(nèi)在聯(lián)系

3、；明確CXCR4抑制劑對(duì)HPH的治療作用，確立CXCR4為新型肺動(dòng)脈高壓治療的藥物靶點(diǎn)。
　　【目的】
　?、僭诘脱跽T導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（Pulmonary arterial smooth cells，PASMCs）中，闡明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與NF-κB、CXCR4的關(guān)系及具體的分子機(jī)制。
　?、诿鞔_PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及NF-κB、CXCR4在HPH肺血管平滑肌細(xì)胞遷移中的作用。

4、>　　③明確CXCR4抑制劑對(duì)肺動(dòng)脈高壓的治療作用，確立CXCR4為肺動(dòng)脈高壓新型治療藥物靶點(diǎn)。
　　【方法和結(jié)果】
　　①我們首先用培養(yǎng)的原代PASMCs，模擬細(xì)胞損傷修復(fù)模型，給予低氧刺激后發(fā)現(xiàn)與常氧組對(duì)比低氧刺激可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移。進(jìn)一步建立低氧誘導(dǎo)的PASMCs損傷修復(fù)模型，分別加入PI3K/mTOR雙抑制劑BEZ-235、mTORC1/C2雙抑制劑OSI-027、mTORC1抑制劑 Rapamycin,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)

5、胞遷移均受抑制。也就是說PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs的遷移起到促進(jìn)作用。
　?、谟肧D大鼠建立低壓低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，4周后測(cè)定其右心室壓力及右心室肥厚指標(biāo)均較常氧組升高；各組肺小血管HE染色提示低氧組肺小血管管壁增厚。各組大鼠肺組織提取蛋白行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKT、mTOR與NF-κB在大鼠HPH肺組織中是活化的。
　?、劢o予PASMCs低氧刺激后提蛋白行Western

6、 blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與常氧組對(duì)比AKT、mTOR和NF-κB蛋白的磷酸化水平均增高。接著我們給予低氧誘導(dǎo)的PASMCs加入PI3K/AKT的抑制劑LY294002，mTOR和NF-κB蛋白的磷酸化水平均受抑制；而加入mTORC1的抑制劑Rapamycin后NF-κB的磷酸化水平受抑制，AKT的磷酸化水平無明顯變化；靶向抑制mTOR及mTORC1的構(gòu)架蛋白R(shí)aptor后，得到了同樣的結(jié)論。提示我們，在低氧誘導(dǎo)的PASMCs中，AKT/mT

7、OR信號(hào)通路促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化。
　?、芪覀?cè)诘脱跽T導(dǎo)的PASMCs，采用免疫共沉淀方法確定了mTOR與IKKα可以相結(jié)合。靶向抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs細(xì)胞中的Raptor蛋白表達(dá)后，再用免疫共沉淀的技術(shù)免疫沉淀mTOR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IKKα是特異性結(jié)合mTORC1的。
　?、菸覀冇迷囵B(yǎng)的PASMCs，給予低氧刺激后行Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與常氧組對(duì)比IKKα/β、IKBα的磷酸化水平增高。若給予低氧處

8、理的同時(shí)加入mTORC1的抑制劑Rapamycin后IKKα/β的磷酸化水平受抑制，靶向抑制mTORC1后，得到同樣結(jié)果。接著我們靶向抑制IKKα/β活性，發(fā)現(xiàn)IKBα和NF-κB蛋白的磷酸化水平與低氧對(duì)照組相比受抑制，這提示我們，在低氧誘導(dǎo)的PASMCs中， mTORC1活化了IKKα/β，IKKα/β的激活又使得下游分子IKBα和NF-κB進(jìn)一步激活。
　?、尬覀兘酉聛碓诘脱跽T導(dǎo)的PASMCs中，靶向抑制NF-κB的表達(dá)后CX

9、CR4蛋白水平與低氧對(duì)照組相比下降；而過表達(dá)NF-κB后，CXCR4蛋白水平與低氧對(duì)照組相比增高。同樣我們采用RT-PCR的方法檢測(cè)NF-κB對(duì)CXCR4轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)同樣受到NF-κB的調(diào)控。接著，我們?cè)诮⒌牡脱跽T導(dǎo)的PASMCs損傷修復(fù)模型中，給予CXCR4的抑制劑AMD3100或者靶向抑制CXCR4后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制CXCR4的表達(dá)對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs損傷修復(fù)有抑制作用。這說明在低氧誘導(dǎo)的PA

10、SMCs中，NF-κB的活化調(diào)節(jié)CXCR4高表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的PASMCs的損傷修復(fù)。
　?、咴趧?dòng)物水平我們驗(yàn)證CXCR4在大鼠HPH中的作用。首先我們用Western blot技術(shù)及免疫組化染色技術(shù)均證明了CXCR4在大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓中是高表達(dá)的。在低壓低氧處理大鼠的同時(shí)給予CXCR4的抑制劑AMD3100，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMD3100注射組大鼠mRVP明顯較低氧組降低、右心室肥厚指標(biāo)明顯下降，肺組織HE染色提示，與低氧組相比

11、肺小血管壁肥厚程度也明顯減輕。由此得出結(jié)論：CXCR4抑制劑AMD3100可以抑制大鼠HPH形成，抑制肺血管與右心系統(tǒng)的重構(gòu)。
　　【結(jié)論】
　　通過本課題的研究，我們證實(shí)了AKT/mTOR信號(hào)通路活化可促進(jìn)PASMCs的損傷修復(fù)；在低氧誘導(dǎo)的PASMCs中，我們發(fā)現(xiàn)mTORC1通過磷酸化調(diào)節(jié)IKKα/β使得NF-κB活化，活化的NF-κB又進(jìn)一步促進(jìn)CXCR4的表達(dá)；CXCR4可促進(jìn)PASMCs的損傷修復(fù)與細(xì)胞遷移，CXC