根癌農桿菌介導紅曲霉轉化庫的構建及轉化子性質研究.pdf

1、紅曲霉(Monasucsruber)是我國重要的微生物資源，能產(chǎn)生許多有用物質，如紅曲色素、莫吶可啉類物質、酶和γ-氨基丁酸等。目前，國內外對紅曲霉代謝產(chǎn)物和發(fā)酵條件的研究很多，但是對紅曲霉分子生物學方面的研究還比較少。該課題建立了以根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為介導的轉化紅曲霉的方法，并初步研究了轉化子的性質，為紅曲霉分子生物學研究奠定了基礎。主要研究結果如下： 1.對影響轉化率的一些因素進行

2、了優(yōu)化，這些因素包括：紅曲霉培養(yǎng)基種類、紅曲霉培養(yǎng)時間、紅曲霉孢子濃度、誘導劑乙酰丁香酮(AS)的濃度、D-半乳糖和AS聯(lián)合使用的作用、根癌農桿菌濃度、共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時間。通過優(yōu)化建立了農桿菌的高效轉化體系為：用PDA培養(yǎng)紅曲霉20d后收集其孢子，孢子濃度為106/ml，誘導劑AS的濃度為80mmol/L，根癌農桿菌的濃度OD600為0.5，根癌農桿菌和紅曲霉孢子于30℃共培養(yǎng)3d。采用此轉化體系構建了含有5,100多個轉化子的轉化

3、庫。 2.提取1～10號轉化子的DNA，根據(jù)T-DNA上已知Gus基因序列設計引物，進行PCR。結果證明轉化子含有插入的T-DNA片段。 3.對轉化子的遺傳穩(wěn)定性進行了分析。隨機挑選14株轉化子，在PDA和含50mg/L潮霉素的PDA上分別傳代6次；同時，將轉化子7號和9號的孢子適當稀釋后分別涂布在PDA和含50mg/L潮霉素的PDA上傳代4次，觀察菌落形態(tài)。結果表明轉化子在遺傳上基本是穩(wěn)定的。 4.將5,100

4、多個轉化子接種于PDA上，30℃培養(yǎng)14～30d，觀察并篩選菌落形態(tài)和顯微特征變異明顯的轉化子。結果得到32株菌落顏色、氣生菌絲、菌落隆起和生長速度都和出發(fā)菌株有明顯差異的轉化子。其中16株的顯微形態(tài)有較大變異，這些變異包括：閉囊殼壁的厚度、分生孢子的形狀、菌絲表面顆粒形狀等。 5.隨機挑選7株變異轉化子，分別接種于米飯培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)14d后，測了它們的色價，并采用紫外可見掃描分析了其色素組成。結果發(fā)現(xiàn)與原始菌株相比，7株轉