小鼠sIL-5Rα基因克隆及在畢赤酵母菌中的表達(dá).pdf

1、哮喘是由嗜酸細(xì)胞（Eosinophil，Eos）和肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的變態(tài)反應(yīng)性氣道慢性炎癥。Eos聚積和活化在炎癥中起至關(guān)重要作用，IL-5對(duì)Eos有選擇性作用，是最重要的Eos生成素?？扇苄訧L-5受體α（sIL-5Rα）是重要的負(fù)性調(diào)節(jié)劑，在體外能阻滯IL-5介導(dǎo)的Eos及嗜堿細(xì)胞活化，具有抗炎癥的潛力。因此，本實(shí)驗(yàn)擬將sIL-5Rα應(yīng)用于哮喘小鼠模型，探討其在哮喘疾病治療中的作用。國(guó)外有人利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)系

2、統(tǒng)表達(dá)出了小鼠IL-5R蛋，也有文獻(xiàn)報(bào)道，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬IL-5Rα胞外區(qū)段蛋白，但二者表達(dá)的蛋白活性和量均不理想。
　　目前畢赤酵母已經(jīng)成為生產(chǎn)外源蛋白重要表達(dá)系統(tǒng)，與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母擁有許多優(yōu)點(diǎn)，不僅沒(méi)有與細(xì)菌相關(guān)的內(nèi)毒素問(wèn)題，也不存在在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中生產(chǎn)蛋白時(shí)濾過(guò)性毒菌引起的蛋白污染。目前在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到小鼠sIL-5Rα基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得分泌表達(dá)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行

3、分泌表達(dá)目的基因，旨在得到小鼠sIL-5Rα重組蛋白，為進(jìn)一步研究sIL-5Rα與sIL-13Rα聯(lián)合應(yīng)用對(duì)哮喘的治療作用，開(kāi)發(fā)新的哮喘治療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　目的：克隆小鼠sIL-5Rα基因，并構(gòu)建其原核表達(dá)載體，然后將小鼠sIL-5Rα基因克隆入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA中，獲得能分泌表達(dá)sIL-5Rα蛋白的重組酵母菌株。
　　方法：采用RT-PCR的方法從BALB/c小鼠脾臟組織中擴(kuò)增得到sIL-5Rα基因片

4、段，酶切鑒定后，將該片段插入克隆載體pMD18-T中，構(gòu)建pMD18-T-sIL-5Rα重組質(zhì)粒，此重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切鑒定后，用大腸桿菌DH5α做受體菌，構(gòu)建pPICZαA-sIL-5Rα重組質(zhì)粒，將此pPICZαA-sIL-5Rα線性化后插入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA中，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，抗生素Zeocin濃度梯度篩選高抗性轉(zhuǎn)化子，以PCR鑒定陽(yáng)性重組菌株。篩選出的高拷貝重組菌株，通過(guò)BMGY/BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)，

5、用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。采用SDS-PAGE和Western Blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：從BALB/c小鼠脾臟組織中提取總RNA，采用RT-PCR方法克隆出sIL-5Rα目的基因片段，片段大小972bp，用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定和DNA測(cè)序的方法均證實(shí)克隆獲得目的基因sIL-5Rα，通過(guò)大腸桿菌做受體菌，最后將該基因成功插入畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA中，并將該重組pPICZαA-sIL-5R