RNAi抑制口蹄疫病毒復(fù)制與感染的相關(guān)研究.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是20世紀(jì)90年代末發(fā)現(xiàn)的一種真核生物細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄后引發(fā)基因沉默的分子機(jī)制，該機(jī)制的發(fā)現(xiàn)被美國(guó)Science雜志評(píng)為2001年世界十大科技進(jìn)展之首，是近年來(lái)分子生物學(xué)最引人關(guān)注的研究進(jìn)展。誘發(fā)RNAi的最關(guān)鍵分子是長(zhǎng)度為19—27個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，稱作小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，并由一系列蛋白復(fù)合物介導(dǎo)，對(duì)與之具有序列同源性的基因在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄

2、后、翻譯等水平進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。SiRNA可以由細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生，或者外源性由病毒感染、轉(zhuǎn)座子侵入、或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)。該機(jī)制在從酵母到哺乳動(dòng)物等真核生物中普遍保守，并證明在這些物種中發(fā)揮著發(fā)育調(diào)控、病毒免疫等重要功能。目前，RNAi的分子機(jī)制及其功能仍然有待更加細(xì)致地闡明，但作為一種反向遺傳學(xué)手段已經(jīng)在基因功能研究中廣泛運(yùn)用，并已作為一種治療策略運(yùn)用于人類抵抗重大遺傳性疾病和病毒性疾病的研究當(dāng)中。本文將對(duì)RNAi的分子機(jī)制，及其抗病毒功能的相關(guān)

3、研究作出簡(jiǎn)要的概括和展望。 口蹄疫(foot—and-mouthdiseas，F(xiàn)MD)是偶蹄類動(dòng)物的高度傳染性疾病，引發(fā)FMD的病原體是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的口蹄疫病毒(FlVlDvirus，F(xiàn)MDV)。VPl基因是FMDV的四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因之一，在病毒感染過(guò)程中該蛋白與易感細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒對(duì)細(xì)胞的感染。我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了兩個(gè)靶向FMDVVPl基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒(pNT21矛~pNT63)，首先在BHK-2

4、1細(xì)胞中評(píng)估了該shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)VPl／綠色熒光蛋白(EGFP)融合報(bào)告基因表達(dá)的抑制效應(yīng)，接著在BHK-21細(xì)胞和乳鼠動(dòng)物模型中進(jìn)一步檢驗(yàn)了它們的抗病毒活性。結(jié)果表明，當(dāng)shRNA表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒(pVP-EGFP-N1)共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因的表達(dá)水平降低了80—90％。在病毒攻擊實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染了shRNA表達(dá)質(zhì)粒的BHK-21細(xì)胞能夠顯著抵抗1.00個(gè)半數(shù)細(xì)胞感染劑量(50％tissuecultureinf

5、ectivedose，TCIDso)FMDV的感染，抗病毒效應(yīng)持續(xù)時(shí)間超過(guò)48小時(shí)。在乳鼠動(dòng)物模型中，用100微克shRNA表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)頸部皮下注射乳鼠，約80％的動(dòng)物在6個(gè)小時(shí)后能夠抵抗20個(gè)半數(shù)動(dòng)物致死劑量(50％animallethaldose，LD50)FMDV的攻擊。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一種增強(qiáng)RNAi效應(yīng)的新途徑，我們構(gòu)建了一個(gè)表達(dá)VPl基因mRNA的質(zhì)粒pVPl，將該質(zhì)粒與shRNA表達(dá)質(zhì)粒共同注射乳鼠可以顯著提高動(dòng)物的保護(hù)率

6、。實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示，RNAi可能成為預(yù)防或治療FMDV感染的可行方法。 發(fā)展RNAi技術(shù)使其成為一種可行的FMDV防御策略面臨一個(gè)重大的挑戰(zhàn)，那就是RNA病毒普遍具有的高度的遺傳多變性。這里，我們通過(guò)序列分析確定了FMDVHKN／2002基因組的5個(gè)保守區(qū)(分別是5’NCR、VP4、VPg、POL和3’NCR)，并采用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)dsRNA、人重組Dicer酶體外剪切的策略獲得雞尾酒siRNA(cocktailsiR

7、NA)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些siRNA的轉(zhuǎn)染能夠有效降低相應(yīng)的保守區(qū)基因與EGFP融合基因在BHK一21細(xì)胞中的表達(dá)水平。在病毒攻擊實(shí)驗(yàn)中，能夠誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞對(duì)0型同源(HKN／2002)和異源(CHA／99)毒株的交叉抑制，在病毒感染48h檢測(cè)到約10-1000倍的抑制效率，而且，抑制效應(yīng)至少持續(xù)了6天。有趣的是，這些HKN／2002特異性的siRNA還能夠顯著抵抗Asial型病毒YNBS／58的感染，在感染后12、24和48h均

8、檢測(cè)到了約10倍的抑制效率，但是該抑制效應(yīng)最多只能持續(xù)約60h。此外，我們觀察到在事先感染了FMDV的BHK-21細(xì)胞中，siRNA的轉(zhuǎn)染對(duì)病毒復(fù)制的抑制似乎更加有效。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向病毒基因組保守區(qū)的RNAi是克服病毒遺傳多變性的一種可行的策略。 業(yè)已證明RNAi作為FMDV防御策略在細(xì)胞水平是有效的，但是在動(dòng)物個(gè)體水平的有效性仍然有待評(píng)估。在這里，我們采用復(fù)制缺陷型的人重組腺病毒(Ad5)作為載體構(gòu)建能夠表達(dá)靶向F

9、MDV1D和3D基因shRNA的新型重組腺病毒(分別為Ad5-NT21和Ad5-POL)。實(shí)驗(yàn)證明，Ad5-NT21和Ad5-POL能夠完全保護(hù)豬IBRS一2細(xì)胞不受同源FMDV毒株的感染，Ad5-POL還能夠抵抗異源FMDV毒株的感染。接著我們利用豚鼠作為動(dòng)物模型，評(píng)估了新型重組腺病毒在動(dòng)物個(gè)體內(nèi)對(duì)FMDV感染的抑制效應(yīng)，結(jié)果表明，每頭豚鼠肌肉注射10。PFU劑量Ad5-POL，在面對(duì)24h后50IDs。同源FMDV攻擊時(shí)，有3／5的

10、動(dòng)物沒(méi)有明顯的口蹄疫疾病癥狀(即在腳掌發(fā)生病毒性水泡)；但是，兩次免疫、或者提高重組腺病毒的劑量、或者同劑量Ad5-NT21／Ad5-POL混和注射等對(duì)免疫方法簡(jiǎn)單地進(jìn)行改進(jìn)并不能提高對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效率；令人。驚訝的是，Ad5-NT21／Ad5-POL的混和注射使豚鼠能夠即刻有效地抵抗50ID50同源FMDV攻擊，這暗示腺病毒介導(dǎo)的RNAi能夠十分快速地抑制病毒的復(fù)制。以豚鼠動(dòng)物模型的抗病毒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為參照，我們進(jìn)一步以易感動(dòng)物而且也是主要

11、的經(jīng)濟(jì)型動(dòng)物之一的家豬作為對(duì)象，評(píng)估了重組腺病毒的抗病毒潛力，結(jié)果顯示，給家豬頸部肌肉注射4×10'PFU劑量Ad5-NT21/Ad5-POL混合腺病毒，有2／3的豬能夠抵抗24h后100IDso同源FMDV的攻擊而不發(fā)生任何明顯的口蹄疫疾病癥狀。Ad5-NT2l和Ad5-POL的抗病毒潛力是特異的，因?yàn)樽鳛閷?duì)照的能夠表達(dá)靶向大腸桿菌LacZ基因shRNA的重組腺病毒Ad5-LacZ沒(méi)有任何顯著的抗病毒活性。 絕大多數(shù)真核生物

12、細(xì)胞擁有一套由dsRNA誘發(fā)的對(duì)具有序列同源性的mRNA產(chǎn)生表達(dá)抑制效應(yīng)的分子機(jī)制，稱為RNA沉默(RNAsilencing)。大量的研究資料表明，RNA沉默是植物和無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞主要的病毒防御機(jī)制。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，該分子機(jī)制也十分保守地存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)中，盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘發(fā)的RNA沉默反應(yīng)的能力似乎比植物或無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞有所減弱。由于脊椎動(dòng)物具備一套完善的蛋白質(zhì)水平的免疫系統(tǒng)(protein-basedimmunesystem)，因

13、此，在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)RNA沉默分子機(jī)制使科學(xué)界對(duì)脊椎動(dòng)物病毒防御機(jī)制的發(fā)展進(jìn)化有了更新的認(rèn)識(shí)。我們認(rèn)為，脊椎動(dòng)物擁有的另一套病毒防御機(jī)制——干擾素系統(tǒng)(IFNsystem)可能是真核生物免疫系統(tǒng)從RNA沉默進(jìn)化到蛋白質(zhì)免疫過(guò)程當(dāng)中的中間產(chǎn)物；干擾素系統(tǒng)的出現(xiàn)可能解釋了RNA沉默機(jī)制在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的弱化以及蛋白質(zhì)免疫系統(tǒng)的發(fā)展與成熟。此外，我們?cè)诒疚闹幸鄰?qiáng)調(diào)，RNA沉默機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為人類更深地了解脊椎動(dòng)物病毒防御機(jī)制乃至生命進(jìn)化提供一