LincRNA1700020I14Rik通過miR-34a-5p-Sirt1-HIF-1α信號(hào)途徑改善糖尿病腎病腎系膜細(xì)胞纖維化及增殖的研究.pdf

1、第一部分 lincRNA1700020I14Rik在糖尿病腎病中的差異表達(dá)及其特征的研究
　　目的：
　　探討候選lincRNA1700020I14Rik在糖尿病腎?。―iabetic nephropathy, DN）小鼠腎臟組織及在高糖培養(yǎng)下的小鼠腎系膜細(xì)胞中的差異表達(dá)及其基本特征。
　　方法：
　　通過高通量RNA sequencing（RNA-seq）技術(shù)，得到在糖尿病腎病小鼠腎臟組織中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼

2、RNA（lncRNA），并從中篩選出基因區(qū)間的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（intergenic long non-coding RNA, lincRNA）。采用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證差異lincRNA在糖尿病腎病小鼠腎臟組織及高糖條件下培養(yǎng)的腎系膜細(xì)胞中的差異表達(dá)。利用ORF Finder以及CAPT（the Coding Potential Assessment Tool）在線軟件，分析1700020I14Rik基因的蛋白編碼能力。運(yùn)用原位熒光

3、雜交（FISH）技術(shù)，觀察候選基因1700020I14Rik在高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞中的表達(dá)，及其定位特征。
　　結(jié)果：
　　通過RNA-seq技術(shù)，得到差異表達(dá)的lncRNAs，經(jīng)過篩選，確定含有42個(gè)lincRNAs，通過在DN小鼠及正常對(duì)照小鼠的腎臟組織的驗(yàn)證，得到7個(gè)lincRNAs在組織中與RNA-seq的結(jié)果表達(dá)一致，進(jìn)一步將這7個(gè)lincRNAs在高、低糖培養(yǎng)的小鼠腎細(xì)胞細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到5個(gè) lincRN

4、As在系膜細(xì)胞中的表達(dá)與在腎臟組織以及RNA-seq的表達(dá)結(jié)果一致。通過分析該5個(gè)lincRNAs在腎臟組織中的表達(dá)豐度以及比對(duì)與人同源序列的保守度，從中挑選出保守性最好表達(dá)豐度較高的lincRNA1700020I14Rik作為研究對(duì)象。通過在線軟件分析，1700020I14Rik無蛋白編碼的能力。經(jīng)原位熒光雜交實(shí)驗(yàn)，確定1700020I14Rik在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中顯著性低表達(dá)，且在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，但在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)較多。<

5、br>　　結(jié)論：
　　lincRNA1700020I14Rik是一種無蛋白編碼能力的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在糖尿病腎病中，其表達(dá)下調(diào)，在腎系膜細(xì)胞中其均有表達(dá)，但主要定位于胞質(zhì)。
　　第二部分 lincRNA1700020I14Rik的差異表達(dá)對(duì)糖尿病腎病小鼠腎系膜細(xì)胞纖維化及增殖的影響
　　目的：
　　探討1700020I14Rik對(duì)糖尿病腎病小鼠系膜細(xì)胞纖維化及增殖的影響。
　　方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法

6、，在腎系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-1700020I14Rik或干擾質(zhì)粒高表達(dá)或沉默1700020I14 Rik基因，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；EDU（Cell Counting Kit-8）、C CK-8（5-ethynyl-2-deoxyuridine labeling/detection kit）檢測(cè)1700020I14Rik對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)1700020I14Rik基因?qū)ο的ぜ?xì)胞的細(xì)胞周期

7、的影響；通過qRT-PCR以及Western blot，檢測(cè)1700020I14Rik對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）、纖維連接蛋白（Fibronectin, FN）及Ⅳ型膠原蛋白（type4 coll agen, Col-4）的調(diào)控。
　　結(jié)果：
　　質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-1700020I14Rik可在細(xì)胞中有效高表達(dá)1700020I14Rik，在三個(gè)干擾質(zhì)粒

8、中，siRNA-832能最有效的沉默1700020I14Rik的表達(dá)；過表達(dá)1700020I14Rik可顯著性降低高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞的增殖以及阻滯細(xì)胞S期，相反，沉默1700020I14Rik后，可顯著增加低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞的增殖以及促進(jìn)細(xì)胞S期發(fā)展。過表達(dá)1700020I14Rik基因可降低系膜細(xì)胞中TGF-β1、FN及Col-4的mRNA水平以及蛋白水平的表達(dá)，而沉默1700020I14Rik后，TGF-β1、FN及Col-4在m

9、RNA水平和蛋白表達(dá)水平上顯著提高。
　　結(jié)論沉默1700020I14Rik的表達(dá)，可促進(jìn)低糖培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞的增殖以及纖維化的發(fā)展，過表達(dá)1700020I14Rik基因后，高糖條件下培養(yǎng)的腎系膜細(xì)胞的纖維化及增殖受到抑制。
　　第三部分1700020I14Rik通過miR-34a-5p/Sirt1/HIF-1α信號(hào)途徑調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞纖維化的發(fā)展
　　目的：
　　探討1700020I14Rik調(diào)節(jié)腎系膜細(xì)胞纖維化

10、的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　運(yùn)用USCS、miRbase和 BiBiserv2軟件，探索與1700020I14Rik靶向結(jié)合的miRNA，篩選出miR-34a-5p；采用qRT-PCR檢測(cè)高、低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染其mimics、inhibitor至系膜細(xì)胞中，qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率以及相應(yīng)的1700020I14Rik的表達(dá)；運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-34a-5p與170

11、0020I14Rik的靶向結(jié)合關(guān)系；運(yùn)用RNA免疫沉淀技術(shù)，探討1700020I14Rik與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,RISC）之間的關(guān)系；EDU、CCK-8檢測(cè)miR-34a-5p對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)系膜細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響；通過Western blot，檢測(cè)miR-34a-5p對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia Inducible Factor1,HIF-1

12、α）、TGF-β1、FN及Col-4的調(diào)控。于低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Silent Information Regulator1,Sirt1) inhibitor以及miR-34a-5p inhibitor質(zhì)粒，檢測(cè)HIF-1α、TGF-β1、FN及Col-4的蛋白表達(dá)。通過在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞共轉(zhuǎn)染1700020I14Rik過表達(dá)質(zhì)粒與miR-34a-5p mimic，檢測(cè)Sirt1、HIF-1α、TGF-β1、FN

13、及Col-4的蛋白表達(dá)；同樣在低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞共轉(zhuǎn)染siRNA-832與miR-34a-5p inhibitor，檢測(cè)Sirt1、HIF-1α、TGF-β1、FN及Col-4的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　通過生物信息預(yù)測(cè)軟件，得到10個(gè)候選miRNA，根據(jù)結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，預(yù)測(cè)miR-34a-5p與1700020I14Rik存在較好的靶向結(jié)合。在系膜細(xì)胞中通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，可有效高表達(dá)或沉默miR-34a-5

14、p,而同時(shí)1700020I14Rik的表達(dá)相應(yīng)的顯著性下降或提高；經(jīng)雙熒光素酶驗(yàn)證后，miR-34a-5p與1700020I14Rik存在直接靶向結(jié)合；RNA免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)1700020I14Rik可結(jié)合到由RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體上；過表達(dá)miR-34a-5p可促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖，增加HIF-1α蛋白以及相關(guān)的纖維化蛋白TGF-β1、FN、Col-4的表達(dá)，而沉默miR-34a-5p后，系膜細(xì)胞的增殖、HIF-1α蛋白以及相關(guān)的纖維化蛋

15、白TGF-β1、FN、Col-4的表達(dá)水平收到抑制。在低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染siRNA-Sirt1以及miR-34a-5p inhibitor后，與只轉(zhuǎn)染miR-34a-5p inhibitor的細(xì)胞相比，HIF-1α蛋白以及相關(guān)的纖維化蛋白TGF-β1、FN、Col-4的表達(dá)顯著提高。在高糖培養(yǎng)下的系膜細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染1700020I14Rik過表達(dá)質(zhì)粒與 miR-34a-5p mimic后，與只轉(zhuǎn)染1700020I14Rik過表達(dá)

16、質(zhì)粒的細(xì)胞組相比，HIF-1α、TGF-β1、FN及Col-4的表達(dá)得到提高，Sirt1的表達(dá)顯著抑制；在低糖中培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染siRNA-832與miR-34a-5p inhibitor后，HIF-1α、TGF-β1、FN及Col-4的表達(dá)與只轉(zhuǎn)染siRNA-1700020I14Rik質(zhì)粒的細(xì)胞組相比顯著抑制，而Sirt1的表達(dá)顯著提高。
　　結(jié)論：
　　1700020I14Rik與miR-34a-5p存在直接靶向結(jié)

17、合的關(guān)系，同時(shí)1700020I14Rik可結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體上，從而參與對(duì)miR-34a-5p的調(diào)節(jié)；miR-34a-5p可促進(jìn)小鼠腎系膜細(xì)胞的纖維化及細(xì)胞增殖的發(fā)展，與1700020I14Rik對(duì)系膜細(xì)胞的調(diào)控作用相反。miR-34a-5p對(duì)腎系膜細(xì)胞的纖維化的作用可通過Sirt1/HIF-1α途徑調(diào)節(jié)。1700020I14Rik對(duì)腎系膜細(xì)胞的纖維化調(diào)節(jié)受miR-34a-5p的影響，其潛在的作用機(jī)制可能是通過miR-34a-