抗埃博拉病毒反義寡核苷酸AVI-7537中間體合成與工藝優(yōu)化研究.pdf

1、埃博拉病毒為絲狀病毒科單股負(fù)鏈RNA病毒，最初于蘇丹南部和剛果（金）的埃博拉河地區(qū)發(fā)現(xiàn)，可通過與攜帶病毒的動(dòng)物或人接觸傳染，且一旦感染致死率極高，其生物安全等級(jí)為4級(jí)，高于SARS病毒與HIV病毒，為對(duì)人類危害最為嚴(yán)重的病毒之一。
　　基于磷酰胺嗎啉寡核苷（Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides,PMOs）結(jié)構(gòu)的抗埃博拉病毒反義寡核苷酸AVI-7537為美國(guó)Sarepta Th

2、erapeutics公司（前AVI公司）研發(fā)的，由19個(gè)嗎啉代核苷以磷酰胺結(jié)構(gòu)連接而成的寡鏈，其可選擇性與埃博拉病毒核衣殼相關(guān)蛋白VP24的mRNA起始密碼子及下游結(jié)合，通過位阻作用使得對(duì)應(yīng)蛋白無法正確合成，最終抑制病毒感染進(jìn)程。已有研究表明該寡鏈可有效提升靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染埃博拉病毒后的存活率。
　　PMOs結(jié)構(gòu)的類模塊化結(jié)構(gòu)亦可通過改變組合方式實(shí)現(xiàn)寡鏈長(zhǎng)度與堿基序列排列的變化以結(jié)合不同的RNA序列，從而實(shí)現(xiàn)不同功能，尤其在抗病毒和

3、治療遺傳病方面有著較為突出的優(yōu)勢(shì)。因此，對(duì)此結(jié)構(gòu)研究也是為建立基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸類藥物平臺(tái)建立一定的理論和物料基礎(chǔ)。
　　本研究主要基于現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，對(duì)目標(biāo)反義寡核苷酸鏈合成中的所有中間產(chǎn)物進(jìn)行合成方法研究與合成工藝優(yōu)化，具體如下：
　　研究目的：基于抗埃博拉反義寡核苷酸鏈AVI-7537，對(duì)所有PMOs成鏈前關(guān)鍵中間產(chǎn)物進(jìn)行合成研究，并進(jìn)行相關(guān)的結(jié)構(gòu)確證。對(duì)各關(guān)鍵中間產(chǎn)物合成方法進(jìn)行優(yōu)化研究，獲得一條高效、便捷

4、、適合放大的合成路線。對(duì)PMOs結(jié)構(gòu)單元嗎啉代核苷單體進(jìn)行物料積累，建立嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù)，為基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸藥物的進(jìn)一步研究建立一定理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　研究?jī)?nèi)容：
　?。?）嗎啉代核苷單體合成研究：以堿基為腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、5-甲基尿嘧啶（T）、N4-苯甲酰胞嘧啶（C）的核苷為原料，對(duì)其結(jié)構(gòu)中的核糖部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，使其形成嗎啉核苷結(jié)構(gòu)，并對(duì)相關(guān)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，使之成為嗎啉代核苷單體。
　　

5、（2）嗎啉代核苷單體合成工藝優(yōu)化研究：通過對(duì)不同方法的嘗試及改進(jìn)，對(duì)嗎啉代核苷單體的合成方法進(jìn)行優(yōu)化，以得到操作便捷，收率較高，同時(shí)成本較為低廉的嗎啉代核苷單體合成工藝。
　　（3）磷酰胺主干結(jié)構(gòu)的合成和工藝優(yōu)化研究：對(duì)AVI-7537中存在的二甲氨基磷酰二氯，以及N-(三氟乙?；哙夯?-N-磷酰二氯2種主干連接體進(jìn)行合成研究，并對(duì)合成工藝進(jìn)行探索與優(yōu)化。
　?。?）磷酰胺嗎啉代核苷的合成研究：以2種主干連接體與4種嗎啉核

6、苷單體作為原料，進(jìn)行PMOs結(jié)構(gòu)成鏈單體磷酰胺嗎啉代核苷的合成研究，最終形成6種可直接合成AVI-7537及其他PMOs結(jié)構(gòu)所需成鏈前單體，包括4種磷酰二甲胺嗎啉代核苷單體以及2種磷酰哌嗪?jiǎn)徇塑諉误w。-
　?。?）關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)分析研究以及嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù)的建立：對(duì)本研究中的關(guān)鍵化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與確證，以確保所合成結(jié)構(gòu)的正確性，并對(duì)嗎啉代核苷單體進(jìn)行物料積累，建立嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù)，為AVI-7537反義寡核苷酸

7、鏈或其他基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸鏈研究打下一定的理論基礎(chǔ)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果：
　　（1）嗎啉代核苷單體合成研究：分別以鳥苷、腺苷、N4-苯甲?；蘸?-甲基尿苷作為原料，對(duì)N2-苯甲酰基-7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥苷、N6-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代腺苷、N4-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷和7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷4種嗎啉代核苷單體進(jìn)行了合成。其中N2-苯甲?；?

8、7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥苷、N4-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷和7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷使用了“堿基伯氨保護(hù)（鳥苷）→嗎啉環(huán)合成→嗎啉環(huán)仲氨基三苯甲基保護(hù)”的路線1，N6-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代腺苷則使用了“嗎啉環(huán)合成→嗎啉環(huán)仲氨基三苯甲基保護(hù)→堿基伯氨保護(hù)（腺苷）”的路線2。
　?。?）嗎啉代核苷單體合成工藝優(yōu)化研究：分別對(duì)4種嗎啉代核苷單體的兩條合成路線進(jìn)行了優(yōu)化，與有完整詳

9、細(xì)報(bào)道的文獻(xiàn)資料相比，采用優(yōu)化后工藝，以路線1合成的N4-苯甲?；?7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷總收率達(dá)60.8％，比文獻(xiàn)報(bào)道收率高11.8%，7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷總收率為43.2%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本持平，N2-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥苷收率26.9%，為未見報(bào)道的全新化合物，該工藝有操作方便、成本較低、收率可觀的優(yōu)點(diǎn)，適合放大合成。采用優(yōu)化后工藝，以路線2合成的N6-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲

10、基嗎啉代腺苷在反應(yīng)時(shí)間、產(chǎn)物純化便捷性上與原方法相比有較大優(yōu)勢(shì)，適合放大合成，雖13.6%的收率低于文獻(xiàn)報(bào)道所述，但依舊遠(yuǎn)高于按文獻(xiàn)方法重復(fù)所得，產(chǎn)生該結(jié)果原因可能與所用試劑有關(guān)。
　?。?）磷酰胺主干連接體結(jié)構(gòu)的合成和工藝優(yōu)化研究：對(duì)連接體結(jié)構(gòu)一，即N-(三氟乙?；哙夯?-N-磷酰二氯的合成方法進(jìn)行了研究，對(duì)其合成步驟進(jìn)行了部分優(yōu)化，相比原工藝操作難度和部分物料使用量有所降低。對(duì)連接體二，即二甲氨基磷酰二氯的合成方法進(jìn)行了研究

11、與篩選，確定了該物質(zhì)的最佳合成方法。N-(三氟乙酰基哌嗪基)-N-磷酰二氯與二甲氨基磷酰二氯的總收率分別為40.3%和75.4%。因連接體分子長(zhǎng)期保存易變質(zhì)，故未對(duì)二者進(jìn)行大量物料積累。
　?。?）磷酰胺嗎啉代核苷單體的合成研究：對(duì)AVI-7537中出現(xiàn)的直接參與成鏈的6種磷酰嗎啉代核苷單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了合成研究，包括4種磷酰二甲氨基嗎啉代核苷單體和2種磷酰哌嗪基嗎啉代核苷單體。其中堿基為胸腺嘧啶的2種磷酰胺嗎啉代核苷單體收率相對(duì)較高

12、，均超過40%，堿基為N2-苯甲酰基鳥嘌呤的磷酰胺嗎啉代核苷單體收率較低，僅14.7%，其余3種磷酰胺嗎啉代核苷單體收率均約為30%。由于磷酰胺嗎啉代核苷并不穩(wěn)定，故未進(jìn)行物料積累。
　　（5）關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)確證以及嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫(kù)的建立：對(duì)4種嗎啉代核苷單體，2種磷酰胺連接體和6種磷酰胺嗎啉代核苷單體以及合成中關(guān)鍵步驟中間產(chǎn)物進(jìn)行了核磁或高分辨質(zhì)譜測(cè)定，保證了所合成物質(zhì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。對(duì)PMOs合成中的最關(guān)鍵中間產(chǎn)物即4種嗎