抗埃博拉病毒反義寡核苷酸AVI-7537中間體合成與工藝優(yōu)化研究.pdf

1、埃博拉病毒為絲狀病毒科單股負鏈RNA病毒，最初于蘇丹南部和剛果（金）的埃博拉河地區(qū)發(fā)現(xiàn)，可通過與攜帶病毒的動物或人接觸傳染，且一旦感染致死率極高，其生物安全等級為4級，高于SARS病毒與HIV病毒，為對人類危害最為嚴重的病毒之一。
　　基于磷酰胺嗎啉寡核苷（Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides,PMOs）結(jié)構(gòu)的抗埃博拉病毒反義寡核苷酸AVI-7537為美國Sarepta Th

2、erapeutics公司（前AVI公司）研發(fā)的，由19個嗎啉代核苷以磷酰胺結(jié)構(gòu)連接而成的寡鏈，其可選擇性與埃博拉病毒核衣殼相關(guān)蛋白VP24的mRNA起始密碼子及下游結(jié)合，通過位阻作用使得對應(yīng)蛋白無法正確合成，最終抑制病毒感染進程。已有研究表明該寡鏈可有效提升靈長類動物感染埃博拉病毒后的存活率。
　　PMOs結(jié)構(gòu)的類模塊化結(jié)構(gòu)亦可通過改變組合方式實現(xiàn)寡鏈長度與堿基序列排列的變化以結(jié)合不同的RNA序列，從而實現(xiàn)不同功能，尤其在抗病毒和

3、治療遺傳病方面有著較為突出的優(yōu)勢。因此，對此結(jié)構(gòu)研究也是為建立基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸類藥物平臺建立一定的理論和物料基礎(chǔ)。
　　本研究主要基于現(xiàn)有文獻資料，對目標反義寡核苷酸鏈合成中的所有中間產(chǎn)物進行合成方法研究與合成工藝優(yōu)化，具體如下：
　　研究目的：基于抗埃博拉反義寡核苷酸鏈AVI-7537，對所有PMOs成鏈前關(guān)鍵中間產(chǎn)物進行合成研究，并進行相關(guān)的結(jié)構(gòu)確證。對各關(guān)鍵中間產(chǎn)物合成方法進行優(yōu)化研究，獲得一條高效、便捷

4、、適合放大的合成路線。對PMOs結(jié)構(gòu)單元嗎啉代核苷單體進行物料積累，建立嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫，為基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸藥物的進一步研究建立一定理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容：
　?。?）嗎啉代核苷單體合成研究：以堿基為腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、5-甲基尿嘧啶（T）、N4-苯甲酰胞嘧啶（C）的核苷為原料，對其結(jié)構(gòu)中的核糖部分進行結(jié)構(gòu)改造，使其形成嗎啉核苷結(jié)構(gòu)，并對相關(guān)基團進行保護，使之成為嗎啉代核苷單體。
　　

5、（2）嗎啉代核苷單體合成工藝優(yōu)化研究：通過對不同方法的嘗試及改進，對嗎啉代核苷單體的合成方法進行優(yōu)化，以得到操作便捷，收率較高，同時成本較為低廉的嗎啉代核苷單體合成工藝。
　　（3）磷酰胺主干結(jié)構(gòu)的合成和工藝優(yōu)化研究：對AVI-7537中存在的二甲氨基磷酰二氯，以及N-(三氟乙?；哙夯?-N-磷酰二氯2種主干連接體進行合成研究，并對合成工藝進行探索與優(yōu)化。
　?。?）磷酰胺嗎啉代核苷的合成研究：以2種主干連接體與4種嗎啉核

6、苷單體作為原料，進行PMOs結(jié)構(gòu)成鏈單體磷酰胺嗎啉代核苷的合成研究，最終形成6種可直接合成AVI-7537及其他PMOs結(jié)構(gòu)所需成鏈前單體，包括4種磷酰二甲胺嗎啉代核苷單體以及2種磷酰哌嗪嗎啉代核苷單體。-
　　（5）關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)分析研究以及嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫的建立：對本研究中的關(guān)鍵化合物結(jié)構(gòu)進行結(jié)構(gòu)分析與確證，以確保所合成結(jié)構(gòu)的正確性，并對嗎啉代核苷單體進行物料積累，建立嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫，為AVI-7537反義寡核苷酸

7、鏈或其他基于PMOs結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸鏈研究打下一定的理論基礎(chǔ)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果：
　?。?）嗎啉代核苷單體合成研究：分別以鳥苷、腺苷、N4-苯甲?；蘸?-甲基尿苷作為原料，對N2-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥苷、N6-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代腺苷、N4-苯甲酰基-7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷和7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷4種嗎啉代核苷單體進行了合成。其中N2-苯甲酰基-

8、7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥苷、N4-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷和7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷使用了“堿基伯氨保護（鳥苷）→嗎啉環(huán)合成→嗎啉環(huán)仲氨基三苯甲基保護”的路線1，N6-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代腺苷則使用了“嗎啉環(huán)合成→嗎啉環(huán)仲氨基三苯甲基保護→堿基伯氨保護（腺苷）”的路線2。
　?。?）嗎啉代核苷單體合成工藝優(yōu)化研究：分別對4種嗎啉代核苷單體的兩條合成路線進行了優(yōu)化，與有完整詳

9、細報道的文獻資料相比，采用優(yōu)化后工藝，以路線1合成的N4-苯甲?；?7?-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胞苷總收率達60.8％，比文獻報道收率高11.8%，7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代胸苷總收率為43.2%，與文獻報道基本持平，N2-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲基嗎啉代鳥苷收率26.9%，為未見報道的全新化合物，該工藝有操作方便、成本較低、收率可觀的優(yōu)點，適合放大合成。采用優(yōu)化后工藝，以路線2合成的N6-苯甲?；?7'-羥基-N-三苯甲

10、基嗎啉代腺苷在反應(yīng)時間、產(chǎn)物純化便捷性上與原方法相比有較大優(yōu)勢，適合放大合成，雖13.6%的收率低于文獻報道所述，但依舊遠高于按文獻方法重復(fù)所得，產(chǎn)生該結(jié)果原因可能與所用試劑有關(guān)。
　?。?）磷酰胺主干連接體結(jié)構(gòu)的合成和工藝優(yōu)化研究：對連接體結(jié)構(gòu)一，即N-(三氟乙?；哙夯?-N-磷酰二氯的合成方法進行了研究，對其合成步驟進行了部分優(yōu)化，相比原工藝操作難度和部分物料使用量有所降低。對連接體二，即二甲氨基磷酰二氯的合成方法進行了研究

11、與篩選，確定了該物質(zhì)的最佳合成方法。N-(三氟乙?；哙夯?-N-磷酰二氯與二甲氨基磷酰二氯的總收率分別為40.3%和75.4%。因連接體分子長期保存易變質(zhì)，故未對二者進行大量物料積累。
　?。?）磷酰胺嗎啉代核苷單體的合成研究：對AVI-7537中出現(xiàn)的直接參與成鏈的6種磷酰嗎啉代核苷單體結(jié)構(gòu)進行了合成研究，包括4種磷酰二甲氨基嗎啉代核苷單體和2種磷酰哌嗪基嗎啉代核苷單體。其中堿基為胸腺嘧啶的2種磷酰胺嗎啉代核苷單體收率相對較高

12、，均超過40%，堿基為N2-苯甲?；B嘌呤的磷酰胺嗎啉代核苷單體收率較低，僅14.7%，其余3種磷酰胺嗎啉代核苷單體收率均約為30%。由于磷酰胺嗎啉代核苷并不穩(wěn)定，故未進行物料積累。
　?。?）關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)確證以及嗎啉代核苷單體物質(zhì)庫的建立：對4種嗎啉代核苷單體，2種磷酰胺連接體和6種磷酰胺嗎啉代核苷單體以及合成中關(guān)鍵步驟中間產(chǎn)物進行了核磁或高分辨質(zhì)譜測定，保證了所合成物質(zhì)結(jié)構(gòu)的準確性。對PMOs合成中的最關(guān)鍵中間產(chǎn)物即4種嗎