體內凝集反應對凝血系統(tǒng)及組織病理影響的研究.pdf

1、目的：二十世紀至今，流感在世界范圍內多次暴發(fā)流行，全球每年約有三百萬到五百萬的重癥流感病例，人感染流感病毒的死亡率可以達到60％以上，其高死亡率和新發(fā)流感病毒的不斷出現(xiàn)對人類健康造成了巨大的威脅。其中，流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)的變異是造成新發(fā)流感病毒流行的關鍵因素。據(jù)研究，重癥感染可以造成廣泛的組織病理損傷及嚴重的并發(fā)癥，甚至出現(xiàn)膿毒癥，導致微循環(huán)障礙和微血栓形成等，并引起繼發(fā)性的全身多器官功能障礙(multi

2、ple organ dysfunction syndrome,MODS)；過去很多研究認為體內較高的病毒載量及過強的炎癥反應是重癥患者免疫病理損傷的主要機制。但是至今為止，仍有許多發(fā)病機制和宿主免疫反應等問題尚未獲得明確闡述。因此需要全面、多方面進行探討研究。血凝素作為病毒膜表面最為主要的糖蛋白，在病毒感染和發(fā)病機制中起著重要作用，也一直是研究的熱點。血凝素不僅是流感病毒的重要組成成分，同時也存在于許多細菌、植物及其他致病微生物中，并且

3、均具有凝集紅細胞的特性。血凝素在體外引起紅細胞發(fā)生凝集反應的現(xiàn)象眾所周知，但對體內凝集反應還尚未見研究。當血凝素在體內達到一定濃度后，可引起凝集反應，是否體內凝集反應在重癥患者繼發(fā)凝血功能失衡、病理損傷、微循環(huán)障礙及微血栓形成中起著不可忽略的作用目前尚無報道；因此，為了更好地驗證體內凝集反應的作用，我們用血凝素誘導體內凝集反應，探究凝集反應對凝血系統(tǒng)、組織病理損傷等的影響，以期為重癥的診療提供新思路。
　　方法：通過體外血凝試驗測

4、得血凝素的凝集效價，根據(jù)大鼠血液總量及血液中紅細胞比例計算血凝素誘發(fā)大鼠體內發(fā)生凝集反應的起始濃度。根據(jù)該濃度將血凝素、滅活的血凝素稀釋成不同濃度(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)，分別經尾靜脈注入大鼠體內，劑量為1.5ml/100g體重,生理鹽水作為對照組。觀察大鼠的一般狀態(tài)、生物學表現(xiàn)；在顯微鏡下觀察凝集反應(10min,30min,2h,4h,6h,12h,24h)，應用比色法觀察溶血現(xiàn)象(30min)。應用10mg

5、/ml濃度HA組別測定不同時間點(1h,2h,4h,6h,12h,24h)凝血指標纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、凝血酶時間(thromboplastin time,TT)、活化的部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)和國際標準化比值(International Normalized Ratio,INR

6、)的變化。根據(jù)凝血指標的變化趨勢，于凝血變化最為明顯的時間點測定各個實驗組不同濃度中(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)凝血指標(FIB、PT、TT、APTT、INR)的變化，及應用蘇木素-伊紅(Haematoxylin and eosin,HE)染色，觀察組織病理變化情況。
　　結果：各濃度的血凝素組(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)均能在體內誘發(fā)凝集反應，并出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。另外，隨著血凝素濃度的增加，凝

7、集反應及溶血現(xiàn)象逐漸明顯。同時，大鼠隨著注射血凝素濃度的增加，逐漸出現(xiàn)異常的生物學表現(xiàn)，包括活動力下降、反應性差、豎毛、弓背、四肢麻痹、呼吸急促、甚至死亡等現(xiàn)象。在凝血指標方面，各濃度(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)血凝素組，F(xiàn)IB測定值分別為(1.25±0.06)g/L、(0.83±0.16)g/L和(0.55±0.23)g/L均顯著低于生理鹽水對照組的(1.95±0.29)g/L,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；濃

8、度為10mg/ml、20mg/ml的血凝素實驗組，PT、TT、APTT、INR測定值分別為：(11.48±1.43)s、(63.85±8.13)s、(23.62±4.06)s、(0.95±0.10)和(14.83±1.00)s、(95.63±2.50)s、(44.50±4.63)s、(1.21±0.11)，均顯著高于對照組的(9.88±0.81)s、(47.97±4.82)s、(17.13±2.14)s和(0.80±0.06)，差異有統(tǒng)

9、計學意義(P＜0.05)。病理學檢查中，鏡下可見肺臟有明顯充血和水腫、炎性細胞浸潤,肺泡間隔破壞等彌漫性肺損泡傷特點，且隨著血凝素濃度的增加，病理變化更加明顯。在20mg/ml的血凝素組，腎臟表現(xiàn)出腎小管的阻塞、水腫、淤血改變；肝臟組織中，肝細胞排列疏松、不規(guī)則，肝細胞變性等。
　　滅活后的各濃度血凝素組，體內外均未引起紅細胞凝集反應及溶血現(xiàn)象，各凝血指標(FIB、PT、TT、APTT、INR)檢測值與生理鹽水對照組差異無顯著性(