HBVx基因在體內(nèi)對(duì)肝組織的影響及作用研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建攜帶HBVx基因的慢病毒表達(dá)載體，感染14-19肝前體細(xì)胞使其穩(wěn)定表達(dá)HBVx基因。通過(guò)門靜脈注射肝前體細(xì)胞入動(dòng)物體內(nèi)，將HBVx基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)后建立動(dòng)物模型，分別檢測(cè)小鼠各個(gè)組織中HBVx目的基因的表達(dá)情況，重點(diǎn)探討在HBVx基因?qū)Ω闻K的作用以及發(fā)生的一系列生物學(xué)變化。
　　方法：
　?。?）通過(guò)PCR擴(kuò)增HBVx目的基因，使之與慢病毒表達(dá)載體(pLenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGF

2、P-F2A-Puro)連接，后通過(guò)酶切、菌落PCR、測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒是否成功構(gòu)建。
　?。?）病毒構(gòu)建成功后，感染14-19肝前體細(xì)胞，用嘌呤霉素(puromycin)連續(xù)篩選4周攜帶HBVx14-19肝前體細(xì)胞，使用PCR、western blot進(jìn)行細(xì)胞HBVx目的基因、蛋白質(zhì)檢測(cè)。
　　（3）同時(shí)進(jìn)行門靜脈動(dòng)物模型構(gòu)建，分別在第3、7、14、30、60天用定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)小鼠各個(gè)組織器官中的HBVx的表達(dá)情況，同時(shí)使

3、用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定小鼠血清內(nèi)AFP和ALT的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　?。?）成功構(gòu)建攜帶HBVx的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，并用慢病毒(pLenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro)成功感染14-19肝前體細(xì)胞，通過(guò)使用嘌呤霉素(puromycin)連續(xù)四周的篩選，成功構(gòu)建了穩(wěn)定攜帶HBVx的14-19肝前體細(xì)胞。
　?。?）成功構(gòu)建門靜脈動(dòng)物模型。并分別于第3、7、14、30、60天用定量PCR

4、方法進(jìn)行檢測(cè)小鼠各個(gè)組織器官中的HBVx的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HBVx只在在肝臟中表達(dá)，不在其他組織內(nèi)表達(dá)；使用Elisa方法分別測(cè)定第3、7、14、30、60天的小鼠血清中AFP、ALT的表達(dá)含量，同對(duì)照組相比的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清內(nèi)的 AFP、ALT含量均升高。
　　結(jié)論：
　　攜帶HBVx的肝前體細(xì)胞可在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)各組織HBVx的表達(dá)量，說(shuō)明HBVx具有嗜肝性，不累及其他臟器。構(gòu)建了一個(gè)長(zhǎng)期表達(dá)HBVx的動(dòng)物