SHH信號通路在新生血管形成中的作用.pdf

1、目的：近年研究發(fā)現(xiàn)，SHH信號通路參與了多種動物缺血模型中的血管再生，包括腦缺血，骨骼肌缺血、角膜及肢體缺血等。然而，SHH信號通路在心肌缺血再灌注中的研究卻很少，并且給予重組人SHH蛋白干預(yù)是否對心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用及其潛在作用機(jī)制是否與激活SHH-Patched-SMO-Gli信號通路有關(guān)尚無文獻(xiàn)報道。而且SHH在急性心肌梗死后冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)的形成中發(fā)揮何種作用及其機(jī)制尚無相關(guān)研究。因此，我們將從以下方面探討：
　

2、　1.研究重組人SHH蛋白對CMECs細(xì)胞凋亡與增殖的影響，探討SHH信號通路激活對大鼠 CMECs缺血再灌注損傷后促血管再生的作用及其潛在機(jī)制，為臨床上心肌缺血再灌注損傷的防治提供理論依據(jù)。
　　2.探討急性心肌梗死患者冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)建立與血漿SHH水平的相關(guān)性，了解SHH在急性心肌梗死后冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)形成中的作用，為臨床上急性心肌梗死治療提供新的治療手段。
　　方法：原代培養(yǎng)SD雄性大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Cardi

3、ac microvascular endothelial cells,CMECs），建立氧糖剝奪/復(fù)氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模擬體外缺血再灌注損傷模型，給予外源性重組人SHH蛋白、Cyclopamine處理，RT-PCR檢測對照組和OGD組中SHH的mRNA水平；用MTT和Annexin-V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡；應(yīng)用ELISA

4、和RT-PCR方法分別檢測血管新生因子(VEGF, FGF, Ang-1)的血清水平和 mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用RT-PCR和 Western blotting方法分別檢測 Sonic hedgehog(SHH)信號通路靶分子(SHH,SMO,Patched-1,Gli-1, Gli-2)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　在臨床試驗(yàn)中，選擇2014年12月-2016年6月于濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院心血管診療中心收治的行急診PCI術(shù)的急性心肌

5、梗死患者298例為研究對象，釆用盲法進(jìn)行 Rentrop評分，分為無側(cè)枝循環(huán)組，側(cè)支循環(huán)較差組和側(cè)性循環(huán)較好組3組。并且采集患者年齡、性別等基本臨床資料以及實(shí)驗(yàn)室檢查的結(jié)果，確定心肌梗死相關(guān)動脈，并記錄梗死發(fā)病的時間。留取患者的術(shù)前血漿標(biāo)本，并采用ELISA法測定血漿SHH水平。釆用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而探討急性心肌梗死患者冠狀動脈側(cè)枝循環(huán)建立與血漿SHH水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果：1.與正常對照組相比，OGD組S

6、HH的mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），上述結(jié)果表明氧糖剝奪/復(fù)氧 CMECs缺血再灌注損傷可以激活SHH信號通路，促使SHH mRNA表達(dá)水平升高。
　　2.與正常對照組相比，加入外源性重組人SHH蛋白后，正常氧糖條件下CMECs的細(xì)胞活力顯著增加，但其影響可以被抑制劑Cyclopamine顯著消減（P＜0.05），上述結(jié)果表明SHH可以促進(jìn)正常氧糖條件下CMECs的細(xì)胞活力增強(qiáng)。相反，當(dāng)細(xì)胞在OGD/

7、R條件下，細(xì)胞活力與正常對照組相比顯著減弱（P＜0.05），表明氧糖剝奪/復(fù)氧會導(dǎo)致細(xì)胞活力受到抑制；而在SHH處理后與OGD組相比細(xì)胞活力顯著增加（P＜0.05）；但其影響也可以被抑制劑Cyclopamine顯著消減（P＜0.05），上述結(jié)果表明SHH可以促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧CMECs的細(xì)胞活力增強(qiáng)。
　　3.與正常對照組相比，加入外源性重組人SHH蛋白后，正常氧糖條件下CMECs的細(xì)胞凋亡僅稍減少（4.09%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、（P＞0.05）；當(dāng)給予抑制劑Cyclopamine處理后CMECs的細(xì)胞凋亡較正常對照組相比僅稍增加（6.43%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在OGD/R條件下，CMECs細(xì)胞凋亡較正常對照組增加（12.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明OGD/R導(dǎo)致了CMECs的細(xì)胞凋亡顯著增加；當(dāng)我們給予激活劑SHH蛋白處理后CMECs的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)顯著減少（5.23%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給予抑制劑Cyclo

9、pamine處理后發(fā)現(xiàn)CMECs細(xì)胞凋亡與OGD組相比顯著增加（16.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），上述結(jié)果表明SHH可以抑制氧糖剝奪/復(fù)氧CMECs的細(xì)胞凋亡。
　　4.與正常對照組相比，加入外源性重組人SHH蛋白后，正常氧糖條件下血管新生因子VEGF, FGF和 Ang-1的血清水平和mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是SHH的生物學(xué)效應(yīng)可以被SHH信號通路特異性抑制劑Cyclopamine

10、所抑制（P＜0.01），上述結(jié)果表明SHH可以促進(jìn)正常氧糖條件下CMECs的血管新生。在OGD/R條件下，血管新生因子VEGF, FGF和 Ang-1的血清水平和mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同樣SHH的生物學(xué)效應(yīng)可以被SHH信號通路特異性抑制劑Cyclopamine所抑制（P＜0.01），上述結(jié)果表明SHH可以促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧CMECs的血管新生。
　　5.加入外源性重組人SHH蛋白后，在OGD/R條

11、件下，SHH信號通路中靶分子SHH,SMO,Patched-1,Gli-1和Gli-2的mRNA表達(dá)水平明顯升高，與OGD組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是SHH的生物學(xué)效應(yīng)可以被SHH信號通路特異性抑制劑Cyclopamine所抑制（P＜0.01）。同樣，在OGD/R條件下，SHH信號通路中靶分子SHH,SMO,Patched-1,Gli-1和Gli-2的蛋白表達(dá)水平明顯升高，與OGD組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05

12、），但SHH的生物學(xué)效應(yīng)也可以被SHH信號通路特異性抑制劑Cyclopamine所抑制（P＜0.01）。以上結(jié)果表明重組人SHH蛋白在激活SHH信號通路的下游信號蛋白表達(dá)過程中扮演重要的角色。
　　6.急性心肌梗死患者冠脈側(cè)枝循環(huán)較差組血漿SHH水平與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；并且冠脈側(cè)枝循環(huán)較好組中血漿SHH水平顯著高于冠脈側(cè)枝循環(huán)較差組以及對照組(P＜0.01)，提示在急性心肌梗死患者冠脈側(cè)枝循環(huán)評分較高的患

13、者中其血漿SHH含量也比較高(P＜0.01)，并且其相關(guān)性獨(dú)立于年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病家族史、心肌梗死類型、吸煙史、飲酒史、空腹血糖水平、血肌酐、血尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、HDL-C、BNP等危險因素單獨(dú)存在。
　　結(jié)論：1.SHH對缺血再灌注損傷的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用；CMECs缺血再灌注損傷存在著SHH信號通路的激活；外源性加入重組人SHH蛋白可以增強(qiáng)細(xì)胞活力，減輕細(xì)胞凋亡，上調(diào)血管新生因子VEGF,

14、 FGF和 Ang-1的表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成，提示SHH信號通路激活在CMECs缺血再灌注損傷后血管再生過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，可能成為心肌缺血再灌注損傷的潛在治療靶點(diǎn)。
　　2.急性心肌梗死患者冠狀動脈側(cè)支循環(huán)建立與血漿SHH水平明顯相關(guān)，且血漿SHH水平獨(dú)立于年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病家族史、心肌梗死類型、吸煙史、飲酒史、空腹血糖水平、血肌酐、血尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、HDL-C、BNP等危險因素作用于急性心