Hedgehog-Gli1信號通路在膠質(zhì)瘤化療耐受及血管新生過程中作用的試驗研究.pdf

1、第一部分，Hedgehog/Glil信號通路在膠質(zhì)瘤化療耐受中作用的實驗研究
　　目的:研究Hedgehog/Glil信號通路在膠質(zhì)瘤復發(fā)過程中的作用.并就其影響膠質(zhì)瘤化療效果的機制進行初步的探討。
　　方法:
　　(1)收集來自30例膠質(zhì)痛病人第一次手術(shù)及復發(fā)后第一次手術(shù)切除的腫瘤組織標本60份.采用免疫組化法分析SHH及Glil蛋白的表達。
　　(2)通過WesternBlot.分析U87、SHG44、U25

2、1及A172四個膠質(zhì)瘤細胞系中Hedgehog/Glil信號通路的活化程度。
　　(3)以胞外配體SHH活化Hedgehog/Glil信號通路.采用克隆生存試驗.檢測這一信號通路活化程度提高后.VCR、VPl6、CDDP及ACNU對A172及U251細胞殺傷作用的變化。
　　(4)以胞外抑制劑Cyclopamine下調(diào)Hedgehog/Glil信號通路的活化程度.觀察這一信號通路的活化程度下調(diào)后.VCR、VPl6、CDDP及

3、ACNU對U87、SHG44、U251及A172細胞生存率及早期凋亡的影響。
　　(5)構(gòu)建以Glil基因為靶向的LV-shGlil.同時構(gòu)建LV-control作為陰性對照.LV-shGlil及LV-contro1分別轉(zhuǎn)染U87、SHG44及U251細胞.采用FACS及WesternBlot分析Hedgehog/Glil信號通路活化程度的變化。
　　(6)使用Cyclopamine及Glil水平的RNAi.下調(diào)U87、SH

4、G44及U251細胞Hedgehog/Glil信號通路的活化程度后.檢測MDRl、MRPl、LRP、MGMT、Bcl-2、Survivin等耐藥相關基因mRNA表達的變化。
　　(7)統(tǒng)計學分析:使用SPSSl6.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析.兩組間均數(shù)的比較采用t險驗.多組間均數(shù)的比較采用方差分析.樣本率間的差別采用卡方檢驗.以P＜O.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　(1)30例膠質(zhì)瘤病人中.23例病人的組

5、織樣本具有Glil的表達.7例病人的組織樣本無Glil的表達。具有Glil表達的這23例膠質(zhì)瘤病人中.復發(fā)的組織樣本(n=23)均具有Glil的表達.而相應的原發(fā)組織樣本中3份無Glil的表達.其余的20份樣本具有Glil的表達.復發(fā)組(n=23)Glil的陽性細胞百分比為48.9±20.3％.相應原發(fā)組(n=23)的Glil陽性細胞百分比為34.4％±19.8％.二者相比具有顯著的統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。以SHH染色對上述60份組

6、織樣本進行分組.SHH陽性組含42份組織樣本.38/42(90.5％)的標本伴有Glil的陽性;而SHH陰性組含18份組織樣本.僅有5/18(27.8％)的標本中有Glil的表達.統(tǒng)計學分析兩組間Glil陽性的樣本數(shù)也有顯著的統(tǒng)計學意義(p﹤0.01)。
　　(2)WesternBlot結(jié)果顯示.U87、SHG44、U251及A172四個膠質(zhì)瘤細胞系均具有Hedgehog/Glil信號通路的活化.在U87及SHG44中這一信號通路

7、活化的程度較高.U251中這一信號通路的活化程度中等.而A172中這一信號通路的活化程度最低。
　　(3)以胞外配體SHH活化U251及A172細胞中Hedgehog/Glil信號通路.隨著該信號通路活化程度的提高.SHH組腫瘤細胞較對照組腫瘤細胞.對VCR、VPl6、CDDP及ACNU的耐受性明顯增強.SHH組腫瘤細胞的克隆存活率顯著增加(P＜O.O1)。
　　(4)Cyclopamine濃度依賴性的方式.下調(diào)U87、SH

8、G44及U251細胞中Hedgehog/Glil信號通路的活化程度.而且隨著這一信號通路活化程度的降低.Cyclopamine組.VCR、VPl6、CDDP及ACNU引起的腫瘤細胞生長抑制及早期凋亡.較對照組明顯增加(p＜0.01或P＜0.05).但在A172細胞中卻沒有上述現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)。
　　(5)U87、SHG44、U251細胞中.Smo水平Cyclopamine的抑制及Glil水平的RNAi均可引起Hedgehog/Glil信號

9、通路的活化程度顯著地降低.而且隨著這一信號通路活化程度的下降.MDR1、MRP1、LRP、MGMT、BcL-2.Survivin等耐藥相關基因表達的也明顯的下調(diào)。
　　(1)在部分膠質(zhì)瘤中存在著異常活化的Hedgehog/Glil信號通路.這一信號通路的過度活化與膠質(zhì)瘤的復發(fā)密切相關.SHH在這一信號通路的活化過程中發(fā)揮了重要作用。
　　(2)}Hedgehog/Gli1信號通路活化程度增加.促進了膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的耐受

10、.而該信號通路活化程度的抑制則導致腫瘤細胞對化療藥物敏感性的增加。
　　(3)膠質(zhì)瘤中Hedgehog/Glil信號通路與MDR1、MRP1、LRP、MGMT、BcL-2、Survivin等一系列耐藥相關基因的表達存在一定的相關性。抑制Hedgehog/Glil信號通路的活性.可相應的下調(diào)MDR1、MRP1、LRP、MGMT、Bcl-2、Survivin等耐藥相關基因的表達。
　　(4)干預膠質(zhì)瘤中Hedgehog/Glil

11、信號通路的活性.可能代表了一種化療增敏、提高療效的治療措施。
　　第二部分，Hedgehog/Glil信號通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤血管新生相關基因表達的實驗研究
　　目的:探討膠質(zhì)瘤中異?；罨腍edgehog/Glil信號通路與血管新生的相關性.以及這一信號通路對VEGF、MMP2及MMP9表達的調(diào)控作用。
　　方法:
　　(1)采用第一部分的組織樣本60份.通過免疫組化分析CD34的表達.探討Glil的表達與MVD計數(shù)

12、的相關性。
　　(2)采用SHH活化Hedgehog/Glil信號通路.觀察該信號通路活化后對VEGF、MMP2及MMP9表達的影響。
　　(3)采用Cyclopamine抑制Hedgehog/Glil信號通路.觀察這一信號通路的活化程度的下調(diào)后.是否伴有VEGF、MMP2及MMP9表達的降低。
　　(4)在Glil的水平進行RNAi.觀察Hedgehog/Glil信號通路被阻斷后.VEGF、MMP2及MMP9表達的變

13、化。
　　結(jié)果:
　　(1)Glil陽性組(n=43)MVD為27.4±4.6.顯著高于Glil陰性組(n=17)的20.9±3.5.組間的MVD差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜O.OO1)。
　　(2)Glil低表達組的MVD為23.7±3.5.中度表達組的MVD為27.3±3.4.高度表達組的MVD為33.2±2.9.各組間MVD具有顯著的差異(p＜0.01).而且Glil的陽性程度與MVD呈正相關(r=0.756.

14、P＜0.01)。
　　(3)Hedgehog/Glil信號通路活化程度上調(diào)后.活化組VEGF、MMP2及MMP9mRNA及蛋白的表達較對照組明顯增高。
　　(4)Cyclopamine抑制Hedgehog/Glil信號通路后.抑制組VEGF、MMP2及MMP9mRNA及蛋白的表達較對照組明顯降低.同時Cyclopamine的抑制作用還具有濃度依賴的特性。
　　(5)Glil水平的RNAi證實.阻斷Hedgehog/Gl

15、il信號通路.對VEGF、MMP2及MMP9mRNA及蛋白的表達具有明顯的下調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　(1)Hedgehog/Glil信號通路與膠質(zhì)瘤的血管新生存在著一定的相關性。
　　(2)Hedgehog/Glil信號通路活化程度的提高.可上調(diào)VEGF、MMP2及MMP9表達;反之.則導致VEGF、MMP2及MMP9表達的降低。
　　(3)抑制Hedgehog/Glil信號通路的活化程度.進而下調(diào)VEGF、M