泛素化和蘇素化修飾對α-突觸核蛋白降解的影響.pdf

1、α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一種包含有140個氨基酸的小分子酸性蛋白質。α-Syn普遍存在于腦部神經(jīng)元內。α-Syn基因的缺失或突變，會引起多種神經(jīng)疾病，特別是誘發(fā)常染色體顯性遺傳性帕金森病。然而，α-Syn突變體誘發(fā)帕金森病的確切機制在很大程上仍未有明確定論。蛋白質翻譯后修飾與神經(jīng)退行性疾病的關系是近年來的研究熱點，尤其是對蛋白質的蘇素化(SUMOylation)、泛素化(Ubiquitination)以及磷

2、酸化(phosphorylation)的研究。但α-Syn的蘇素化、泛素化與α-Syn降解過程的研究報道較少。因此，這項研究中，我們主要探討蘇素(Small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)和泛素(Ubiquitin)在α-Syn降解途徑中的作用，揭示SUMO和Ubiquitin對α-Syn的降解通路轉換的影響。研究結果將豐富帕金森病發(fā)病過程中蛋白質降解的機理。
　　本研究首先用兩步

3、法PCR技術構建帶有Flag標簽的野生型和突變型Ubiquitin真核表達質粒，即Flag-Ubiquitin WT、K29A、K48A、K63A以及雙突變型G75AG76A。通過雙酶切和基因測序確定序列的正確性；通過Western Blot方法確定重組質粒在細胞上的表達；通過免疫熒光標記技術了解野生型和突變型Flag-Ubiquitin在細胞內分布特征；通過LDH和WST-1的檢測分析野生型和突變型Flag-Ubiquitin的細胞毒

4、性。發(fā)現(xiàn)野生型和突變型Flag-Ubiquitin多分布于細胞胞漿，但在細胞核內也有少量分布。突變型Flag-Ubiquitin均有不同程度的細胞毒性，其中Flag-Ubiquitin G75AG76A的毒性最大。其次，B103細胞分別瞬時轉染α-Syn WT和A53T質粒，然后用濃度為200μg/mL的Hygromycin B建立具有抗性篩選的穩(wěn)定表達α-SynWT、A53T的兩種B103細胞株。最后，在穩(wěn)定表達α-Syn WT和A5

5、3T的B103細胞株上，分別瞬時轉染重組質粒Flag-Ubiquitin，通過免疫熒光標記分別檢測α-Syn與SUMO、Ubiquitin以及與26S蛋白酶體定位結合情況。結果發(fā)現(xiàn)在B103細胞內，Ubiquitin與SUMO無明顯共定位現(xiàn)象，而在穩(wěn)定轉染α-Syn的細胞內，卻發(fā)現(xiàn)α-Syn與Ubiquitin、SUMO和26S蛋白酶體以及Ubiquitin與SUMO均有明顯的共定位現(xiàn)象，修飾的α-Syn一部分由泛素介導的蛋白酶體系統(tǒng)降