CHIP促進(jìn)心肌素泛素化和降解及抑制平滑肌細(xì)胞分化的分子機(jī)理.pdf

1、正常血管平滑肌細(xì)胞(SMC)高度分化，但是在血管損傷效應(yīng)發(fā)生時(shí)，SMC則向增殖表型轉(zhuǎn)換。研究表明許多因素包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等可調(diào)節(jié)血管SMC表型轉(zhuǎn)化。其中心肌素(myocardin)是近年來(lái)在平滑肌細(xì)胞分化和表型轉(zhuǎn)換方面具有重要意義的一個(gè)發(fā)現(xiàn)。目前已知，心肌素是最有效的SRF(serum response factor)共同激活因子，通過(guò)Q—富集功能區(qū)與SRF結(jié)合形成復(fù)合物，激活CArG盒子依賴(lài)的平滑肌細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，

2、是平滑肌細(xì)胞發(fā)育和分化所必需的共激活轉(zhuǎn)錄因子。但是到目前為止，調(diào)節(jié)心肌素蛋白水平和活性的分子機(jī)制尚未完全闡明。 近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后修飾特別是磷酸化、Sumoylation和泛素化對(duì)底物蛋白和酶的活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。其中，泛素E3連接酶可有效地識(shí)別和泛素化蛋白底物，促進(jìn)其被泛素—蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-Proteasome system)降解。CHIP(Hsc70羧基末端反應(yīng)蛋白)是一個(gè)重要的控制蛋白質(zhì)量的泛素E

3、3連接酶，可促進(jìn)多種蛋白底物被泛素—蛋白酶體系統(tǒng)降解和清除，在心肌細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡、腫瘤、熱應(yīng)急等方面起著非常重要的作用。但是CHIP調(diào)節(jié)SMC表型轉(zhuǎn)換和動(dòng)脈血管收縮性的分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此，本研究主要探討了CHIP調(diào)節(jié)心肌素的蛋白水平和活性，促進(jìn)SMC表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。本文發(fā)現(xiàn)： 1)過(guò)度表達(dá)CHIP不僅抑制心肌素依賴(lài)的SMC標(biāo)志基因如SMα—actin，SM—MHC和SM22α的表達(dá)，顯著降低SM22α—l

4、uc或ANF—luc熒光素酶報(bào)告基因活性和心肌素的蛋白水平，而且這種抑制效應(yīng)依賴(lài)于CHIP U—box結(jié)構(gòu)域的存在。 2)轉(zhuǎn)染siRNA—CHIP不僅促進(jìn)SMC標(biāo)志基因的表達(dá)，而且使SM22α報(bào)告基因活性明顯增加。 3)GST-Pull down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)CHIP在體內(nèi)外均可與心肌素直接相互結(jié)合，而不是通過(guò)Hsp70和Hsp90。CHIP正負(fù)電荷區(qū)是結(jié)合心肌素的結(jié)構(gòu)域，而心肌素C末端的TAD轉(zhuǎn)錄激活區(qū)是結(jié)合CH

5、IP的結(jié)構(gòu)域。免疫組化染色顯示它們共定位于SMC胞漿中。 4)Pulse—chase實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CHIP能明顯下調(diào)心肌素的蛋白水平，而且這種作用可以被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷。體內(nèi)外泛素化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CHIP可以促進(jìn)心肌素泛素化和降解，而且這種泛素化過(guò)程依賴(lài)于CHIPE3連接酶活性。同時(shí)，心肌素的TAD結(jié)構(gòu)域是被CHIP泛素化所必需的。 5)CHIP介導(dǎo)的心肌素泛素化依賴(lài)GSK—3β誘導(dǎo)的磷酸化修飾。 6)