口服Lal對(duì)正常新生鼠、成年鼠脾臟Th1-Th2平衡及誘導(dǎo)哮喘模型的影響.pdf

1、目的：隨著工業(yè)化的進(jìn)程、衛(wèi)生條件改善、疫苗的研制和抗生素的發(fā)現(xiàn)，使發(fā)達(dá)國(guó)家感染性疾病的發(fā)生逐年下降，但過敏性疾病，例如支氣管哮喘、變應(yīng)性皮炎等的發(fā)生率卻在逐年上升。支氣管哮喘是一種以呼吸道高反應(yīng)性和慢性炎性反應(yīng)為主要特征并反復(fù)發(fā)作的變態(tài)反應(yīng)性疾病，是全球最常見的慢性疾病之一。主要表現(xiàn)為Th1型細(xì)胞功能和數(shù)量不足，Th2型細(xì)胞反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)?；颊叩腡h2型細(xì)胞可產(chǎn)生過多的IL-4、IL-5和IL-13，通過促進(jìn)抗原特異性IgE的產(chǎn)生，刺激嗜酸

2、性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞增殖、分化和聚集，啟動(dòng)和維持哮喘的高變應(yīng)性氣道炎。因此，Th1和Th2型細(xì)胞之間比例和功能的失調(diào)被認(rèn)為是支氣管哮喘的主要免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，恢復(fù)二者間的平衡已成為治療支氣管哮喘的重要策略?？诜嫔徽J(rèn)為是改善Th1和Th2型細(xì)胞之間平衡的一種有效措施。
　　 哮喘發(fā)病機(jī)制中的衛(wèi)生學(xué)假說認(rèn)為，適度的微生物刺激對(duì)形成人體正常的免疫功能是必須的。益生菌是以活菌形式提供補(bǔ)充，通過促進(jìn)腸道微生物的平衡對(duì)宿主產(chǎn)

3、生友誼影響。益生菌能通過自身的代謝活動(dòng)供給或促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)有害物質(zhì)的排泄，還能通過自身的代謝，如產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、分泌蛋白質(zhì)等活動(dòng)，阻止致病菌的侵襲，維持腸道菌群的平衡，它們是對(duì)宿主發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要菌群。益生菌分為三種類型：雙歧桿菌、乳酸菌和兼性厭氧菌，它們對(duì)宿主有不同的作用，目前臨床研究最多的是鼠李糖乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌。益生菌的作用機(jī)制也不同。臨床實(shí)驗(yàn)證明，乳酸菌通過增加分泌IgA的漿細(xì)胞的數(shù)量，或改善吞噬細(xì)胞的功能，

4、或增加T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞的數(shù)量來提高宿主的免疫功能，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平均有不同程度的降低。
　　 我們選擇Lactobacillus johnsonii Ncc533(Lal)作為研究對(duì)象?？诜﨤al后，我們研究了從新生鼠到成年鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞中IL-4和IFN-γ和血清中特異IgE水平的變化。在成年鼠中，我們建立哮喘模型，并繼續(xù)研究各組小鼠脾臟CD4+T淋

5、巴細(xì)胞中IL-4和IFN-γ和血清中特異IgE水平的變化，希望為支氣管哮喘的免疫治療提供一條新的途徑。
　　 方法：
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑
　　 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年BALB/C小鼠雌性20只，體質(zhì)量24-28g，平均26.04g；雄性5只，體質(zhì)量26-30g，平均27.86g。由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。雌雄4:1交配，通過觀察雌鼠陰道栓確定其懷孕日期。
　　 1.2實(shí)驗(yàn)試劑及藥物直接單抗IL

6、-4-PE、IFN-γ-PE購(gòu)自Immunotich公司，破膜劑購(gòu)自Caltag公司Fix&Perm，卵清蛋白(OVA)、佛波醇酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)、莫能霉素(monensin)和卵蛋白粉(OVA，grade V)均購(gòu)自Sigma公司，OVA特異IgE購(gòu)自上海迪奧生物科技有限公司，Lactobacillusjohnsonii Ncc533(Lal)懸液(1×1012CFU/L)購(gòu)自雀巢研究中心。PMA貯存液：PM

7、A溶于二甲基亞砜(DMSO)，濃度為0.1mmol/ml，-20℃保存。臨用前用RPMI1640(無PHA、無菌、無NaN3)稀釋成50μg/L。ionomycin貯存液：ionomycin溶于DMSO中，濃度為1mg/ml，-20℃保存。臨用前用RPMI1640(無PHA、無菌、無NaN3)稀釋成1mg/L。monensin貯存液：ionomycin溶于甲醇中，濃度為50mg/ml，為加速溶解可置于40-43℃水浴，-20℃保存。臨用

8、前用RPMI1640(無PHA、無菌、無NaN3)稀釋2mg/L。細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI1640)：RPMI1640液中含2mmol/L谷酰胺，50μg/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素和100μg/ml新霉素。流式細(xì)胞儀為Beckman Comlter公司產(chǎn)品，型號(hào)為Epics-XL。
　　 2分組及干預(yù)方法將孕鼠隨機(jī)分為兩組，每組各10只。1組為L(zhǎng)actobacillus johnsonii Ncc533(Lal)干預(yù)組，用L

9、actobacillus johnsonii Ncc533(Lal)懸液灌胃2-3周，每次2ml，每日2次。2組為無菌蒸餾水干預(yù)組，用蒸餾水灌胃2-3周，每次2ml，每日2次。仔鼠出生后，1組共生育56只仔鼠，2組共生育62只仔鼠，1’組為1組仔鼠，2'組為2組仔鼠，各組隨機(jī)抽取7只小鼠，分別分離各組小鼠的脾臟單個(gè)核細(xì)胞，各檢。各組仔鼠再隨機(jī)抽取20只，繼續(xù)用Lal懸液和無菌蒸餾水灌胃4周，每次1ml，每日2次。4周后，各組隨機(jī)抽取7只

10、小鼠，A組為1組仔鼠，B組為2組仔鼠，分離脾臟單個(gè)核細(xì)胞，備檢。在各組剩余小鼠中隨機(jī)抽取7只，A'組為1組仔鼠，B'組為2組仔鼠，C'組為健康對(duì)照小鼠，選用4-6周齡的BALB/c小鼠，7只。
　　 3建立哮喘模型 A'組和B'組小鼠分別于第1天和第14天致敏，每只小鼠0.2ml致敏劑溶液(20μg OVA和2mg氫氧化鋁溶入0.2ml無菌PBS中)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射；第21天開始激發(fā)。將小鼠置入30cm×18cm×13cm的密閉透

11、明的玻璃箱內(nèi)，以20g/L OVA PBS氣霧劑霧化吸入進(jìn)行激發(fā)，1次/天，20min/次，持續(xù)5天。C'組小鼠用無菌PBS進(jìn)行同樣操作，不予OVA激發(fā)。
　　 4各組CD4+T細(xì)胞IL-4及IFN-γ表達(dá)的檢測(cè)(1)脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離：分離1'組、2'組、A組、B組、A'組、B'組和C'組小鼠脾臟，300目鋼網(wǎng)研磨，獲得脾細(xì)胞懸液。1000r/min離心7min，棄上清。加入10ml紅細(xì)胞裂解液，靜置4min，再次1000r/

12、min離心7min，棄上清，得到單個(gè)核細(xì)胞。(2)CD4+T細(xì)胞分離：每107個(gè)細(xì)胞用90μL Buffer(PBS，包含5g/L牛血清清蛋白和2mmolEDTA)重懸，加入10μL CD4+磁珠，4～8℃孵育15min，用500μL Buffer重懸。將MS細(xì)胞分離柱置于MiniMACS磁力架上，將細(xì)胞懸液通過離心柱，500μLBuffer沖洗離心柱3次，將離心柱置于合適的收集管上，吸取1mL Buffer加入分離柱內(nèi)，應(yīng)用配套的內(nèi)芯

13、迅速將管內(nèi)液體壓到收集管內(nèi)，得到CD4+T淋巴細(xì)胞。(3)抗體標(biāo)記：加入PMA(50μg/L)、離子霉素(1mg/L)和莫能霉素(2mg/L)刺激培養(yǎng)4～6h，收集細(xì)胞，2000r/min離心5min，加入破膜劑10mL，室溫下避光孵育10min。加入直接單抗IL-4-PE、IFN-γ-PE，室溫避光孵育30min，洗細(xì)胞1次，各檢。(4)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀分析，氫離子激發(fā)光波長(zhǎng)400nm，各熒光通道均以相應(yīng)同型IgG染色

14、細(xì)胞為陰性對(duì)照，獲取20000個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)各區(qū)的百分率。
　　 5血清OVA特異IgE檢測(cè)采用ELISA技術(shù)，我們檢測(cè)出各組小鼠血清中OVA特異IgE抗體水平。
　　 6肺組織病理改變分離A'組、B'組和C'組小鼠肺組織置于40g/L甲醛中浸泡固定24h，常規(guī)石蠟切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。
　　 7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

15、br>　　 結(jié)果：
　　 1.1'組和2'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4和IFN-γ水平比較
　　 1'組和2'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，說明在新生鼠中口服Lal和無菌蒸餾水對(duì)脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平無影響。
　　 1'組和2'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，說明在新生鼠中口服Lal和無菌蒸餾水對(duì)脾臟CD4+T細(xì)胞I

16、FN-γ水平無影響。
　　 2.A組和B組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4和IFN-γ水平比較
　　 A組和B組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，說明在成年鼠中口服Lal和無菌蒸餾水對(duì)脾臟CD4+T細(xì)胞IL-4水平無影響。
　　 A組和B組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，說明在成年鼠中口服Lal和無菌蒸餾水對(duì)脾臟CD4+T細(xì)胞IFN-γ水平無影

17、響。
　　 3.A'組、B'組和C'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4和IFN-γ水平比較
　　 A'組和C'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)，說明在哮喘小鼠中脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平升高。
　　 B'組和C'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)，說明在哮喘小鼠中脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平升高。
　　 A'組和B'組小

18、鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，說明在Lal干預(yù)下，哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平較無菌蒸餾水組明顯升高，Lal干預(yù)對(duì)哮喘有保護(hù)作用。
　　 A'組和C'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)；說明哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平降低。
　　 B'組和C'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，

19、說明哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平降低。
　　 A'組和B'組小鼠CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)，說明在Lal干預(yù)下，哮喘小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平較無菌蒸餾水組明顯降低，Lal干預(yù)對(duì)哮喘有保護(hù)作用。
　　 4.A'組、B'組和C'組小鼠血清OVA特異IgE抗體水平的比較
　　 A'組和C'組小鼠血清OVA特異IgE抗體水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.

20、05)。A'組小鼠血清OVA特異IgE抗體水平較C'組顯著增加，說明哮喘小鼠造模成功，誘發(fā)了哮喘。
　　 B'組和C'組小鼠血清OVA特異IgE抗體水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。B'組小鼠血清OVA特異IgE抗體水平較C'組增加，說明哮喘小鼠造模成功，誘發(fā)了哮喘。
　　 A'組和B'組小鼠血清OVA特異IgE抗體水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p

21、al干預(yù)后，A'組小鼠哮喘癥狀較B'組小鼠輕。
　　 5.A'組、B'組和C'組小鼠肺組織改變
　　 A'組、B'組HE染色鏡下可見氣道上皮下有肥大細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。氣道粘膜下組織水腫，管腔變窄，氣道分泌物增多。但B'組病變較A'組明顯嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)多，氣道粘膜下組織水腫明顯，氣道分泌物多，管腔狹窄更明顯。C'組小鼠肺組織光鏡下所見正常，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)清晰，支氣管粘膜上皮完整