應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默NF-κB基因的實驗性研究.pdf

1、廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默NFκB基因的實驗性研究姓名：丁慶軍申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：梁統(tǒng)周克元20080501應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默NFxB基因的實驗性研究摘要目的設(shè)計并篩選到針對NF—rB／p65(relA)的RNA干擾的最有效靶點。構(gòu)建重組腺病毒，感染小鼠成肌細胞并表達設(shè)計的siRNA，通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)作用，沉默NFrB／p65基因，抑制NFrB

2、／p65的表達。探討對致炎因子生成的影響，為進一步研究實驗性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。方法根據(jù)Ambion公司提供的軟件，按照RNAi的設(shè)計原則，設(shè)計3個NF—xB／p65的干擾靶點，并據(jù)設(shè)計相應(yīng)的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(shorthairpinRNA，shRNA)合成相應(yīng)RNA的DNA模板，通過T4連接酶，將這些DNA分別插入shuttlevector10CMV質(zhì)粒中形成3種重組質(zhì)粒。用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入小鼠成肌細胞(C2C1

3、2)。通過RTPCR方法比較各mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，進而篩選出沉默效果最好的表達質(zhì)粒。用所選出的重組質(zhì)粒與腺病毒骨架(AdenovirallacZBackbone)線性化后共轉(zhuǎn)染293細胞得到重組腺病毒。用重組腺病毒感染C2C12細胞檢測其感染的效果。結(jié)果shRNA的DNA模板成功插入到shuttlevector10CMV表達質(zhì)粒，形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入C2C12細胞并篩選出沉默效果最好的質(zhì)粒。篩選出的重組質(zhì)粒與腺病毒共轉(zhuǎn)染293細胞