應用RNAi技術沉默RhoC基因調控炎性乳腺癌增殖、侵襲和轉移的實驗研究.pdf

1、目的：炎性乳腺癌是原發(fā)性乳腺癌中惡性度最高的腫瘤，約占全部乳腺癌的1％～6％。IBC 亦是一種特殊的局部晚期乳腺癌，腫瘤細胞侵襲性和轉移性強，死亡率非常高。IBC組織學無明顯特異性，可表現為浸潤性導管癌、小葉細胞癌等，常見血管和淋巴管癌栓。IBC 腫瘤細胞呈低分化，并多伴局部淋巴結浸潤。由于IBC 惡性程度極高，病情發(fā)展迅速，早期即有全身廣泛轉移而危及生命，預后非常差。當前臨床上主要采取以手術、放療、化療等綜合治療措施來處理這類疾病，但

2、是治療效果極其有限。近年來，有研究發(fā)現，癌基因RhoC在絕大多數炎性乳腺癌中廣泛表達，并且參與IBC的生長、侵襲和轉移等生物學活動。這一發(fā)現為IBC的分子靶向治療提供了方向。本研究旨在探討利用RNA 干擾技術沉默IBCSUM190細胞株RhoC基因，分析其對IBC SUM190細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響。
　　 方法：收集66例乳腺良性疾病組織和94例乳腺癌組織，采用免疫組化方法，應用彩色圖像灰度掃描分析系統檢測RhoC 蛋

3、白的表達，并分析其臨床意義。在體外實驗中，人IBC SUM190細胞隨機分成對照組與實驗組，對照組不加轉染試劑僅加細胞培養(yǎng)液，實驗組加入轉染試劑脂質體2000和相關試劑正常轉染。以脂質體介導的RhoC-siRNA 轉染人IBC SUM190細胞株。轉染后48 小時，以半定量RT-PCR檢測人IBC SUM190細胞中RhoC mRNA的表達水平，以Western blot法測定人IBC SUM190細胞中RhoC 蛋白的表達水平。在轉染

4、后0、24、48、72小時時間點，以MTT 法檢測人IBC SUM190細胞生長情況。細胞生長速度以吸光度A 值表示。在轉染后48 小時，應用流式細胞儀檢測人IBC SUM190細胞的凋亡情況。應用transwell 小孔法檢測人IBC SUM190細胞的侵襲和轉移能力的變化。在細胞侵襲實驗中，穿膜細胞數代表腫瘤細胞侵襲能力；在細胞轉移試驗中，穿膜細胞數代表腫瘤轉移運動能力。采用RT-PCR法檢測RhoC-siRNA 轉染人IBCSUM

5、190細胞后KAI1、MMP9、CXCR4 mRNA的表達。另外，采用免疫細胞化學法分析RhoC-siRNA 轉染后人IBC SUM190細胞中KAI1、MMP9、CXCR4 蛋白的表達情況。
　　 結果：RhoC 蛋白在乳腺良性疾病組織和乳腺癌組織中表達的平均灰度值分別為（0.051±0.014）、（0.328±0.122），二者之間差異有統計學意義。RhoC 蛋白在年齡＜45歲和≥45歲乳腺癌中表達的平均灰度值分別為（0.3

6、07±0.111）、（0.358±0.172），二者之間差異無統計學意義。無腋淋巴結轉移乳腺癌中RhoC 蛋白表達的平均灰度值（0.266±0.107），有腋淋巴結轉移乳腺癌中RhoC 蛋白表達的平均灰度值（0.409±0.187），二者之間差異有統計學意義。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌中RhoC表達的平均灰度值(0.237±0.088)，Ⅲ期乳腺癌中RhoC表達的平均灰度值（0.435±0.211），二者之間差異有統計學意義。在體外實驗中，以Rho

7、C-siRNA 轉染人IBC SUM190細胞，發(fā)現轉染效率可以達到70％。轉染后48 小時，對照組中人IBC SUM190細胞RhoC mRNA表達水平（0.907±0.387），實驗組中人IBC SUM190細胞RhoC mRNA表達水平（0.367±0.152），二者之間差異有統計學意義。對照組中人IBC SUM190細胞RhoC 蛋白表達水平（0.914±0.389），實驗組中人IBC SUM190細胞RhoC 蛋白表達水平（0

8、.375±0.164），二者之間差異有統計學意義。在轉染后0、24、48、72 小時各時間點，對照組人IBC SUM190細胞生長速度（吸光度A值）分別為（0.43±0.09）、（0.57±0.20）、（1.32±0.48)、（1.88±0.68)，實驗組人IBC SUM190細胞生長速度（吸光度A 值）分別為（0.45±0.12）、（0.50±0.17）、（1.28±0.40）、（1.75±0.57），四個時相點二者之間的差異均無統計

9、學意義。對照組IBC SUM190細胞G0/G1 期細胞比例（52.26±3.68）％，實驗組IBC SUM190細胞G0/G1 期細胞比例（55.38±3.85）％，二者之間差異無統計學意義。對照組IBC SUM190細胞S 期細胞比例（23.78±1.42）％，實驗組IBC SUM190細胞S 期細胞比例（21.15±1.26）％，二者之間差異無統計學意義。對照組人IBC SUM190細胞凋亡率（4.77±0.34）％，實驗組人IB

10、C SUM190細胞凋亡率（5.25±0.45）％，二者之間差異無統計學意義。在細胞侵襲實驗中，對照組人IBC SUM190細胞穿膜細胞數（352.2±50.6），實驗組人IBC SUM190細胞穿膜細胞數（85.6±12.7），二者之間差異有統計學意義。在細胞轉移實驗中，對照組人IBC SUM190細胞穿膜細胞數（189.6±23.3），實驗組人IBC SUM190細胞穿膜細胞數（46.6±7.7），二者之間差異有統計學意義。RhoC

11、-siRNA 轉染人IBC SUM190細胞48 小時后，對照組、實驗組KAI1 mRNA表達水平分別為（0.462±0.192）、（0.762±0.281），二者之間差異有統計學意義。對照組、實驗組MMP9 mRNA表達水平分別為（0.889±0.349）、（0.587±0.212），二者之間差異有統計學意義。對照組、實驗組CXCR4 mRNA表達水平分別為（0.873±0.331）、（0.620±0.277），二者之間差異有統計學意

12、義。KAI1 蛋白在對照組和實驗組中表達分別為(0.54±0.11)、(1.13±0.39)，二者之間差異有統計學意義。MMP9蛋白在對照組和實驗組中表達分別為(1.28±0.45)、(0.68±0.20)，二者之間差異有統計學意義。CXCR4 蛋白在對照組和實驗組中表達分別為（1.35±0.50）、（0.77±0.23），二者之間差異有統計學意義。
　　 結論：RhoC 蛋白在原發(fā)性乳腺癌組織中高表達，其表達與腫瘤病理特征密切