NIX基因在膠質瘤中調控NF-κB的臨床及實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　 膠質瘤作為顱內最常見的惡性腫瘤，約占全部原發(fā)中樞神經系統(tǒng)腫瘤的70％，依據WHO2007年的分類:Ⅰ/Ⅱ級腫瘤稱為低級別的膠質瘤，包括毛細胞型星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤、神經節(jié)膠質瘤、少突膠質瘤及混合性少突星形細胞瘤等;高級別膠質瘤亦稱惡性膠質瘤，即Ⅲ/Ⅳ級腫瘤，包括星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、間變性星形細胞瘤等。盡管近年來顯微外科手術、放療、化療以及生物治療等多模式治療的應用，但大多數腫瘤患者的預后仍然

2、十分悲觀，術后同步放化療的治療方案也僅僅是增加了新診斷GBM患者有限的中位生存期。但是從目前的臨床隨訪結果來看，仍有部分惡性膠質瘤有較長的生存期，目前對于膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后以及放化療耐藥的分子機理仍然存在著諸多的疑問，在不同病理級別的膠質瘤或者相同病理級別不同預后的膠質瘤之間尋找差異基因，對于闡明決定預后的分子機制不失為一種有效的策略。
　　 BNIP3是bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，BNIP3a(又稱ni

3、p-likeprotein X，Nix)作為BNIP3成員之一，同BNIP3一樣具有BH3結構域和跨膜區(qū)，與Bcl-2、Bcl-X1等蛋白相互作用，通過線粒體途徑促進細胞的凋亡.Nix在腫瘤的進展中扮演著重要的角色，缺氧和甲基化可以誘導Nix的表達異常，促進Nix的表達可以誘導腫瘤細胞凋亡。
　　 核轉錄因子kappa B(NF-κB)是一類重要的轉錄激活因子，通過和某些基因上啟動子區(qū)的固定核苷酸序列結合而啟動基因轉錄的功能，廣

4、泛存在于各種真核細胞中。NF-κ出與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，它通過不同的作用機制廣泛參與多種致瘤基因、細胞因子的轉錄調節(jié)。NF-κB既可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也能在特定的病理生理狀態(tài)下抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此深入探討NF-κB在腫瘤中的作用有重要的意義。
　　 本研究通過檢測Nix和p-NF-κB在膠質瘤中的表達，并采用siRNA干擾Nix在膠質瘤細胞中的表達，檢測細胞內NF-κB通路上蛋白的變化以及干擾后對在不同培養(yǎng)條件下細胞

5、凋亡的影響，尋找Nix與NF-κB通路相互關系的證據，為發(fā)現(xiàn)腦膠質瘤治療新靶點提供依據。
　　 研究內容與方法：
　　 1.Nix蛋白和p-NF-κB在膠質瘤中的表達以及Nix蛋白表達與預后的關系。
　　 實驗材料:按照納入標準收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院神經外科2007年1月至2009年1月經常規(guī)HE切片后確診為腦膠質瘤的標本46例，以上病例均有較完整的臨床資料和術后長期隨訪結果?；颊呒{入標準:1.南方醫(yī)院神經外科

6、2007-2009經手術確診為星形細胞瘤（AS，WHOⅡ級）、間變性星形細胞瘤(AA，WHOⅢ級)、膠質母細胞瘤（GBM，WHOⅣ級）病例;2.首次就診且術前未行化療或者放療;3.惡性膠質瘤(AA和GBM)術后行替莫唑胺同步放化療治療;4.隨訪5年以上;5.病歷資料完整。
　　 實驗方法:利用RT-PCR檢測Nix在膠質瘤組織中mRNA的表達量;利用Western blot方法檢測Nix、IκBα以及總p-NF-κB蛋白表達水平

7、，采用免疫組織化學技術檢測46例Ki-67膠質瘤中的表達情況，用Olympus OlysiaBioreport圖像分析系統(tǒng)測試10個視野Ki-67區(qū)域陽性的百分率，分析在不同病理類型的腫瘤組織中Ki-67與Nix蛋白表達之間的關系。采用原位TUNEL法檢測42例腫瘤組織細胞的凋亡情況（另4例應為標本體積和質量不好未能檢測），用Olympus OlysiaBioreport圖像分析系統(tǒng)測試10個視野凋亡細胞出現(xiàn)的百分率，分析在不同病理類型

8、的腫瘤組織中凋亡率與Nix蛋白表達之間的相互關系。采用Kaplan—Meier法進行生存分析。
　　 2.Nix基因在膠質瘤中的功能及初步分子機制研究
　　 通過設計合成Nix基因siRNA干擾片段瞬時轉染膠質瘤細胞U251，同時以si-Scrambled片段作為空白對照(Nix-wt)。利用Western blot檢測干擾效率，選取干擾效率最高的siRNA片段。實驗設空白對照組(Nix-wt)、實驗組(Nix-kn)。

9、
　　 (1)轉染48小時后每組又分別用正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)處理，12小時后采用Western blot檢測每組細胞內總p-NF-κB/p65、p-IκBα、p-IKKα、IκBα蛋白的表達和核內p-NF-κB/p65蛋白的表達;用EMSA和luciferase報告基因檢測每組細胞核內NF-κB的活性;
　　 (2)轉染48小時后每組又分別用正常培養(yǎng)和LB培養(yǎng)處理，12小時后用流式細胞術和DAPI熒光染色檢測Nix基因在細

10、胞水平對正常培養(yǎng)和LB培養(yǎng)下細胞凋亡的影響;
　　 以上統(tǒng)計學分析應用SPSS15.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。采用2獨立樣本t檢驗分析對數據進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05表示差異具有顯著性。應用2獨立樣本非參數的方法分析在不同病理類型的腫瘤中患者的KPS評分與Nix蛋白表達之間的關系。采用Kaplan—Meier法進行生存分析，顯著性檢驗采用Logrank法。
　　 結果：
　　 一.Nix蛋白和p-NF-κB在膠質

11、瘤中的表達以及Nix蛋白表達與預后的關系
　　 1.Nix蛋白和p-NF-κB在膠質瘤組織中的表達利用western blot進行46例膠質瘤組織中Nix及p-NF-κB蛋白的表達檢測，結果顯示17例腫瘤組織高表達Nix蛋白，其中有6例AS、5例AA、6例GBM，且在不同病理類型的腫瘤組織內，Nix和p-NF-κB蛋白的高表達與IκBα蛋白的低表達有較好的一致性;利用qRT-PCR技術檢測46例膠質瘤組織中Nix mRNA的表達

12、水平，結果顯示病理類型為GBM的腫瘤組織與AS和AA相比，膠質瘤中的Nix表達顯著上調（P值分別為0.003和0.027），但是AS與AA相比，Nix在膠質瘤中表達未見明顯差別，將每種病理類型分為Nix(+)和Nix(-)兩組，結果顯示在AS組內，Nix基因的mRNA水平有明顯差異(P=0.04)，在高級別的腫瘤組織中(AA和GBM)未見這種差異。
　　 2.Nix蛋白表達與預后的關系為了證實Nix蛋白與腫瘤的生物學行為及預后之

13、間的關系，分析患者的Ki-67與Nix蛋白表達的相互關系，結果發(fā)現(xiàn)在18例AS中，Nix(-)患者的Ki-67蛋白表達較Nix(+)顯著增高(P=0.037)，暗示Nix陰性表達的腫瘤有更高的侵襲力，在13例AA和16例GBM組內，Ki-67蛋白表達在Nix(-)患者和Nix(+)患者之間未見明顯差異.;分析46例患者的KPS評分與Nix蛋白表達的關系，結果發(fā)現(xiàn)在AS和AA組內，Nix(+)患者的KPS評分較Nix(-)增高（P值為0.

14、045和0.047），在GBM組內未見這種差異性;分析42例腫瘤組織細胞的原位TUNEL法凋亡檢測結果顯示，在GBM組內，Nix(-)患者的凋亡率較Nix(+)顯著增高(P=0.015)，在AS和AA組內未見這種差異。生存分析的結果顯示，所有膠質瘤病人中，Nix(+)組患者腫瘤無進展生存期明顯長于Nix(-)組(P=0.038)，亞組分析顯示，在AS組中，這種差別更大，而在高級別的膠質瘤（AA和GBM）中，這種差別不顯著。
　　

15、 二.Nix基因在膠質瘤細胞的功能初步研究用western blot進行Nix蛋白的表達檢測，4種干擾片段較空白對照均具有較強的干擾效率，在Nix siRNA轉染膠質瘤U251細胞48h后，與空白對照組相比，Nix的表達顯著降低。在膠質細胞瘤U251的空白對照組(Nix-wt)、實驗組(Nix-kn)組內又分別進行正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)兩種不同處理，空白對照組缺氧培養(yǎng)較正常培養(yǎng)下的p-NF-κB/p65、p-Iκ Bα、p-IKKα、細胞核

16、內p-NF-κB/p65蛋白表達升高、IκBα蛋白表達下降，在實驗組(Nix-kn)缺氧培養(yǎng)和正常培養(yǎng)下的p-NF-κB/p65、p-Iκ Bα、p-IKKα、細胞核內p-NF-κB/p65蛋白表達未見差異;采用EMSA的方法檢測正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)兩種不同處理下的空白對照組（Nix-wt）、實驗組(Nix-kn)膠質瘤U251細胞核內的NF-κB活性，結果顯示在缺氧條件下，實驗組(Nix-kn)激活的NF-κB高表達，其他組間未見有表達

17、。Luciferase報告基因檢測每組細胞核內NF-κB的活性結果顯示，DMEM培養(yǎng)組內，Nix表達下調后， U251細胞細胞核內NF-κB的表達和陰性對照組比較差異無顯著意義(P=0.086)在LB培養(yǎng)組內，Nix表達下調后，U251細胞細胞核內NF-κB的表達較陰性對照組明顯增多(P=0.011)。采用流式細胞術分析膠質瘤細胞U251的細胞凋亡分布改變，結果發(fā)現(xiàn)，在DMEM培養(yǎng)組內，Nix表達下調后， U251細胞凋亡和空白對照組比

18、較差異無顯著意義(Nix-wt3.09±1.65％，Nix-kn4.04±0.89％，P=0.43)在LB培養(yǎng)組內，Nix表達下調后， U251細胞凋亡較陰性對照組明顯增多（Nix-wt7.15±0.87％， Nix-kn11.24±2.15％，P=0.037）;DAPI熒光染色檢測膠質瘤細胞U251的細胞凋亡結果顯示，在DMEM培養(yǎng)組內，Nix表達下調后， U251細胞凋亡和陰性對照組比較差異無顯著意義(Nix-wt3.43±1.47

19、％，Nix-kn3.52±2.4％，P=0.95)在LB培養(yǎng)組內，Nix表達下調后， U251細胞凋亡較陰性對照組明顯增多(Nix-wt7.37±1.17％, Nix-kn13.33±3.28％, P=0.041)。
　　 結論：
　　 Nix蛋白在膠質瘤的形成過程中可能扮演了雙重角色，在NF-κB低表達的低級別的膠質瘤(Ⅱ級)中，Nix蛋白通過BAX促進腫瘤細胞凋亡，是腫瘤抑制因子，而在高級別的膠質瘤中（Ⅲ級和Ⅳ級）中