應(yīng)用短發(fā)夾狀RNA沉默NF-κB基因促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)發(fā)生的中心事件是由于肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)激活，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellullar matrix，ECM)生成過(guò)多、降解相對(duì)不足，在肝內(nèi)大量沉積，而I型膠原占沉積ECM的70％以上。在HF恢復(fù)期，HSC凋亡明顯增多，一方面消除了ECM的來(lái)源，另一方面也解除了金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloprot

2、einase，TIMP)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的抑制作用，從而促進(jìn)胞外基質(zhì)的降解。因此，誘導(dǎo)活化HSC凋亡可使HF發(fā)生逆轉(zhuǎn)。 NF-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)在多種細(xì)胞中高表達(dá)，不同的Rel/NF-κB家族成員可以結(jié)合成不同的二聚體。在這些二聚體中，最常見(jiàn)的形式是由p50和p65組成的異源二聚體。在絕大多數(shù)靜止期的細(xì)胞中，NF-κB與

3、其抑制物IκB(the inhibitor of κB，IκB)蛋白相結(jié)合，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。NF-κB可以被多種刺激物所激活，如TNF-α、IL-1、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等，這些刺激物可以通過(guò)對(duì)IκB的磷酸化而使其降解，并與NF-κB解離，暴露NF-κB的核識(shí)別位點(diǎn)，使其進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)下游的靶基因的轉(zhuǎn)錄。 NF-κB的激活在細(xì)胞生存、黏附、分化和細(xì)胞生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。而且，活化的NF

4、-κB信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)其下游的靶基因如COX2、cyclinD1、bcl-2等，抑制細(xì)胞的凋亡。并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NF-κB的激活通過(guò)阻止Caspase-8的激活抑制了Caspase的起始，從而抑制了Caspase-3的激活，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的凋亡。研究表明，在靜止態(tài)HSC中NF-κB并無(wú)活性，但在激活態(tài)HSC中，活性卻持續(xù)存在，因此有理由相信NF-κB可能通過(guò)抑制HSC的凋亡而使活化的HSC數(shù)量維持在相當(dāng)?shù)乃?，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。NF-

5、κB的這一特性，使得這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子成為一個(gè)有前途的分子靶點(diǎn)。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)是目前研究基因功能強(qiáng)有力的工具之一，能夠用于研究特定基因的表達(dá)抑制。迄今為止，NF-κB參與多種炎癥、免疫、細(xì)胞增殖和凋亡等病理、生理過(guò)程的調(diào)控已見(jiàn)較多報(bào)道，但NF-κB在肝纖維化及HSC增殖、凋亡中的作用報(bào)道甚少。為此，本研究應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以LPS激活NF-κB，利用RNAi技術(shù)特異性的抑制NF-κB亞單位p65

6、的表達(dá)，研究活化的NF-κB表達(dá)受到抑制后，對(duì)HSC凋亡的影響及其可能機(jī)制，抑制肝纖維化作用。 目的：應(yīng)用p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC，探討p65shRNA對(duì)NF-κB表達(dá)的影響，以及對(duì)HSC凋亡的影響及其可能機(jī)制。 方法：應(yīng)用含2％胎牛血清、100IU·ml-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素、4mmol·L-1谷氨酰胺及1mol·L-1HEPES的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5％CO2條件下體外培養(yǎng)HSC。應(yīng)用RNAi技

7、術(shù)特異性的抑制NF-κB亞單位p65的表達(dá)，通過(guò)熒光顯微鏡篩選出熒光素標(biāo)記的對(duì)照shRNA在HSC中轉(zhuǎn)染效率最高的最佳濃度和作用時(shí)間；Western blotting方法檢測(cè)HSC中p65及其下游抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)；采用流式細(xì)胞儀、TUNEL染色及DNA ladder法檢測(cè)p65shRNA對(duì)HSC凋亡的影響；采用Caspase-3活性試劑盒檢測(cè)p65shRNA對(duì)Caspase-3活性的影響；明膠酶譜法測(cè)定明膠酶的活性；RT-PC

8、R共擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)I型前膠原mRNA表達(dá)。 結(jié)果：①shRNA轉(zhuǎn)染HSC的效率：將熒光素標(biāo)記的對(duì)照shRNA轉(zhuǎn)染HSC，通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示200pmol shRNA組轉(zhuǎn)染72h效率最高，可達(dá)90％以上。②p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC后對(duì)NF-κB阻斷作用：Western blot結(jié)果表明，LPS作用于HSC后，p65蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組(2.34±0.26 vs 0.61±0.11)，升高了227.42％，

9、P＜0.01；但與脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，P＞0.05。p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC 72h后，p65蛋白表達(dá)量顯著降低(0.27±0.09 vs 2.19±0.26)，較陰性對(duì)照組降低87.67％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，P＜0.01。③p65shRNA對(duì)HSC凋亡的影響：流式細(xì)胞儀和TUNEL染色法測(cè)定均顯示：經(jīng)LPS處理后，LPS組、脂質(zhì)體組與陰性對(duì)照組間無(wú)組間差異，P＞0.05，均低于空白對(duì)照組，P＜0.05；p65

10、shRNA轉(zhuǎn)染HSC 72h后，與空白對(duì)照組、LPS組、脂質(zhì)體組與陰性對(duì)照組相比，可明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。表明在LPS激活NF-κB后，抑制HSC凋亡，Np65shRNA轉(zhuǎn)染組特異性抑制NF-κB表達(dá)后，可有效的促進(jìn)細(xì)胞凋亡。DNA ladder檢測(cè)p65shRNA轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)梯狀條帶，也表明p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC 72h后，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。④p65shRNA阻斷NF-κB信號(hào)通路下調(diào)bcl-2的表達(dá)：Western blot結(jié)果表明

11、，LPS作用于HSC后，bcl-2蛋白表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組(1.80±0.07 vs 0.59±0.11)，升高了205.08％，P＜0.05；但與脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，P＞0.05。p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC 72h后，bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(0.31±0.14 vs 1.17±0.06)，較陰性對(duì)照組降低81.87％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，P＜0.01。表明在LPS激活NF-κB后，促進(jìn)其下游調(diào)控基因bc

12、l-2的表達(dá)，而p65shRNA轉(zhuǎn)染組特異抑制NF-κB表達(dá)后，可下調(diào)bcl-2的蛋白表達(dá)。⑤p65shRNA阻斷NF-κB信號(hào)通路激活Caspase-3活性：Caspase-3活性檢測(cè)顯示：經(jīng)LPS處理后，LPS組、脂質(zhì)體組與陰性對(duì)照組間無(wú)組間差異，P＞0.05；均低于空白對(duì)照組，P＜0.05；p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC 72h后，與空白對(duì)照組、LPS組、脂質(zhì)體組與陰性對(duì)照組相比，可明顯增高Caspase-3活性，P＜0.01。表明在

13、LPS激活NF-κB的表達(dá)后，Caspase-3活性受抑；而p65shRNA轉(zhuǎn)染組特異抑制NF-κB表達(dá)后，可有效的激活Caspase-3活性。⑥p65shRNA阻斷NF-κB信號(hào)通路增強(qiáng)明膠酶活性：明膠酶譜法測(cè)定：p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC 72h后，與空白對(duì)照組、LPS組、脂質(zhì)體組與陰性對(duì)照組相比，可明顯增高明膠酶活性，P＜0.01。表p65shRNA轉(zhuǎn)染組特異抑制NF-κB表達(dá)后，可有效的增強(qiáng)明膠酶活性。⑦p65shRNA阻斷NF

14、-κB信號(hào)通路后下調(diào)I型前膠原表達(dá)：RT-PCR共擴(kuò)增檢測(cè)I型前膠原和內(nèi)參GAPDH基因表達(dá)，掃描結(jié)果分析顯示：p65shRNA轉(zhuǎn)染HSC 72h后，與空白對(duì)照組、LPS組、脂質(zhì)體組與陰性對(duì)照組相比，I型前膠原表達(dá)明顯降低，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。 結(jié)論：RNA干擾技術(shù)是研究基因功能的強(qiáng)有力的手段之一，p65shRNA可以特異性的阻斷NF-κB基因表達(dá)；可以促進(jìn)HSC的凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB下游基因中抗凋亡蛋白