NF-κB在實驗性暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡中的作用及其機制.pdf

1、目的：暴發(fā)性肝衰竭(fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF)是由多種原因引起的大量肝細胞壞死而出現(xiàn)嚴重的肝功能障礙，病人短期內(nèi)進展至肝性腦病的一種綜合征。具有起病急、進展快、病死率高的特點，迄今仍無有效治療措施。雖然近年來在暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機制、臨床診斷、治療等方面的研究取得了較大進展，但其發(fā)病機制仍不甚明確。發(fā)病機制的研究是提高FHF的防治水平的關(guān)鍵。 目前研究認為，F(xiàn)HF發(fā)生大塊肝細胞壞死的病理過程中，

2、細胞凋亡起著重要的作用。細胞凋亡的發(fā)生受凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。凋亡調(diào)控基因可分為誘導(dǎo)基因和抑制基因。正常情況下兩者表達平衡，若因某些因素刺激使其失衡，則導(dǎo)致疾病發(fā)生。Survivin是目前已知的抗凋亡作用最強的凋亡抑制蛋白.C-myc是誘導(dǎo)細胞凋亡的重要因素。 核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor of kappa B，NF-kB)是一種廣泛存在于細胞中的具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，可啟動許多與細胞凋亡調(diào)控有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄，

3、如凋亡蛋白酶(caspase)、Bcl-2蛋白家族、死亡受體、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)和某些原癌基因等。在肝臟炎癥、纖維化、肝細胞凋亡與再生等病理生理過程中均伴有NF-kB的活化，是調(diào)控肝臟病理損害的重要轉(zhuǎn)錄因子。但是由于刺激NF-kB活化的因素不同，活化的靶基因不同，NF-kB在調(diào)控細胞凋亡方面也發(fā)揮著不同的作用，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑既可抑制肝細胞的凋亡亦可促進肝細胞的凋亡。但目

4、前國內(nèi)外研究多集中在肝臟腫瘤方面，對其在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡的作用研究較少，其機制尚不清楚。 為此，本研究采用免疫組織化學(xué)和Western blotting方法檢測暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝組織NF-kB、survivin和c-myc的表達情況，通過形態(tài)學(xué)和流式細胞學(xué)觀察肝細胞凋亡情況，分析NF-kB活性與肝細胞凋亡程度、凋亡抑制蛋白survivin、原癌基因c-myc的關(guān)系，從細胞和蛋白水平探討NF-kB在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡中的

5、作用及作用機制。為臨床如何應(yīng)用NF-kB抑制劑治療暴發(fā)性肝衰竭提供理論依據(jù)。 方法： 1.研究對象：雄性Wistar大鼠45只，清潔級，體重180～200g。將大鼠隨機分為模型組30只，對照組15只。模型組腹腔注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-GalN)800mg/kg，之后皮內(nèi)注射脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)10μg/kg，制造暴發(fā)性肝衰竭模型。對照組注射同樣體積的生理

6、鹽水。 2.標本的采集和保存：分別于注藥后2、4、8、12、24小時行股靜脈放血處死，各時間點取模型組6只，對照組3只大鼠放血處死后立即剖腹取出肝臟，取適量肝組織分別經(jīng)10％中性甲醛溶液、70％乙醇及4％戊二醛固定，部分經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?3.光鏡及電鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。 4.采用免疫組化S-P法，對肝組織標本進行NF-kBp65、survivin和c-myc的免疫組化染色。結(jié)果評估參照F

7、romowitz[9]的綜合計分法進行。分別按染色細胞的分布和染色深度計分，最終結(jié)果用陰性、弱陽性、陽性、強陽性來表示。 5.Western blotting檢測細胞核內(nèi)NF-κB蛋白和總蛋白內(nèi)survivin蛋白的表達。 6.流式細胞術(shù)進行細胞凋亡率定量檢測和細胞周期分析。 7.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用秩和檢驗和Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.01時有顯著性差異。

8、 結(jié)果： 1.一般狀況觀察：對照組大鼠一般狀況較好，無死亡。模型組隨著給藥時間延長，大鼠依次出現(xiàn)活動減少、精神萎靡、毛發(fā)豎立、反應(yīng)遲鈍、嗜睡、昏迷。 2.肝組織形態(tài)學(xué)觀察：(1)大體標本觀察：對照組大鼠肝臟基本正常。模型組肝組織隨著給藥時間延長出現(xiàn)腫脹、充血、出血點、局部淤血、壞死，肝組織脆性增加。(2)HE染色：對照組肝組織基本正常。模型組肝組織隨給藥時間延長病理損害逐漸加重。光鏡下可觀察到肝細胞水腫、嗜酸性變，凋亡

9、小體形成，炎性細胞浸潤，肝組織出血，肝細胞大片壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞。(3)電鏡下觀察：對照組大鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠肝細胞明顯腫脹，肝細胞核不規(guī)則，核膜向外呈銳角突起；核染色質(zhì)高度濃縮，邊集于核膜下；線粒體腫脹明顯，脊變短并部分消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，并有脫顆?，F(xiàn)象。 3.肝組織NF-κB檢測結(jié)果：(1)免疫組化方法：對照組主要為少量非實質(zhì)細胞(肝竇內(nèi)皮細胞和庫普弗細胞)染色陽性，細胞漿弱表達，極少見細胞核內(nèi)有陽性物質(zhì)表

10、達。模型組表達陽性細胞主要為肝細胞、庫普弗細胞。2h組主要是肝細胞的胞漿著色，4h、8h、12h時核陽性表達的細胞數(shù)明顯增多，明顯高于對照組(P＜0.01)。(2)Westernblotting 方法：對照組肝細胞胞核中有極少量NF-κBp65蛋白存在，各時間點表達無明顯差別(P＞0.05)。模型組2、4、8、12h細胞核內(nèi)NF-kB含量逐漸增加(P＜0.01)。 4.肝組織survivin檢測結(jié)果：(1)免疫組化方法：對照組肝

11、組織未檢測到survivin蛋白表達。模型組survivin蛋白主要表達在肝細胞胞漿內(nèi)。隨著肝組織病變程度的加重，陽性細胞表達程度逐漸增加(P＜0.01)。(2)Western blotting方法：對照組肝細胞中幾乎無survivin蛋白表達。模型組隨著肝組織病變程度的加重，survivin蛋白表達逐漸增高(P＜0.01)。 5.免疫組化方法檢測c-myc蛋白表達：對照組肝組織內(nèi)未檢測到c-myc蛋白表達。模型組c-myc蛋白

12、主要表達在肝細胞胞漿內(nèi)，隨著肝組織病變程度加重，陽性細胞表達程度逐漸增加(P＜0.01)。 6.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果：(1)細胞凋亡率：對照組肝細胞凋亡率較低，各時間點凋亡率無明顯差別(P＞0.05)。模型組2h、4h、8h、12h肝細胞凋亡率隨著給藥時間的延長，肝細胞凋亡率依次呈顯著上升趨勢(P＜0.01)。(2)細胞周期變化：與對照組相比模型組的周期改變主要表現(xiàn)在G1期縮短(細胞比例減少)和S期延長(細胞比例增加)(P＜0.0

13、5)。7.NF-kB與survivin、c-myc、細胞凋亡率的關(guān)系：NF-kB與survivin、c-myc、細胞凋亡率之間均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.820，P＜0.01； r=0.827，P＜0.01；r=0.613，P＜0.01)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用D-GalN+LPS造?？煞从潮┌l(fā)性肝衰竭發(fā)生的病理變化過程，并可動態(tài)觀察暴發(fā)性肝衰竭肝臟組織病變演變過程，適于暴發(fā)性肝衰竭發(fā)病機制的研究。 2.從細胞和蛋白水平

14、證實了NF-kB參與了暴發(fā)性肝衰竭的病理損傷。正常情況下肝臟非實質(zhì)細胞漿有少量表達。暴發(fā)性肝衰竭時，肝細胞核中NF-kB表達隨病情進展而增高，是導(dǎo)致暴發(fā)性肝衰竭的重要的因素。 3.從形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)和凋亡相關(guān)基因方面證實肝細胞凋亡在暴發(fā)性肝衰竭病理過程中起著重要的作用。 4 從細胞和蛋白水平證實了NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡中起著重要作用。在疾病進展的過程中，它既可以使抗凋亡基因survivin表達增加也可以使促凋亡