不同亞型HIV-1假病毒顆粒共-超感染研究方法的建立及MazF抗體的制備.pdf

1、人類免疫缺陷病毒1型屬于高變異和高重組力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前全球AIDS的流行主要為M群造成，其主要包括11個亞型和51種流行重組型(CirculatingRecombinantForms，CRFs)。分析51種CRFs發(fā)現(xiàn)，有些亞型比其它亞型更容易參與到CRFs中，暗示不同亞型HIV-1可能具有不同的重組潛力。眾所周知，不同亞型共/超感染是重組發(fā)生的前提。為檢測不同亞型的共/超感染能力是否存在差異，我們建立了一種可以檢測HIV-1不同亞

2、型共/超感染潛力的方法，即構(gòu)建六種不同HIV-1亞型(A、B、C、D、G、CRF-01_AE)囊膜蛋白的重組載體。此外，我們還經(jīng)俄亥俄州大學武力教授饋贈獲得分別攜帶紅色熒光蛋白(Redfluorescentprotein，RFP)和綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)并缺失Env及Nef的HIV-1缺陷型載體(pHIV1-eGFP/pHIV1-RFP)。通過將囊膜蛋白表達載體與HIV-1缺陷型載體共轉(zhuǎn)染

3、HEK293T細胞，包裝出12種單次感染的HIV-1假病毒顆粒。將假病毒顆粒濃縮，感染2×104HUT/CCR5細胞，72小時后通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)20-30％的細胞呈現(xiàn)熒光。為驗證假病毒顆粒是否可用于共感染潛力分析，分別隨機選取攜帶GFP或RFP不同亞型的HIV-1單次感染假病毒顆粒感染2×104HUT/CCR5細胞，72小時后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各亞型均呈現(xiàn)出不同程度的雙感染細胞，表明這些細胞會被兩種病毒粒子

4、所感染。為繼續(xù)驗證假病毒顆粒是否可以對超感染進行研究，分別選取共感染中所用亞型攜帶GFP的HIV-1單次感染假病毒顆粒感染HUT/CCR5細胞，8小時后加入帶有RFP的另一亞型假病毒顆粒再次感染，72小時后通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，相比于共感染，在2個超感染處理組中未發(fā)現(xiàn)雙感染細胞，其他亞型間均存在超感染現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示，我們所建立的方法可以用于檢測HIV-1共感染及超感染的潛力。
　　 從1983年發(fā)現(xiàn)至今，AIDS已在全球范

5、圍內(nèi)流行了30年，但是，到目前為止沒有一種疫苗能夠激發(fā)機體產(chǎn)生有效的免疫。我們設(shè)想使用一種帶有毒素蛋白的逆轉(zhuǎn)錄載體來研制治療性HIV-1疫苗，當這種載體轉(zhuǎn)染細胞之后，會表達毒素蛋白并且降解HIV-1基因組RNA。MazF是大腸桿菌中可以特異切割mRNA中的ACA位點的一種毒素蛋白，在HIV-1基因組中有超過240個ACA位點，因此，HIV-1基因組所編碼的mRNA也能被MazF有效剪切。所以對于制備治療性HIV-1疫苗，MazF是一個很

6、好的備選蛋白。由于MzaF能剪切自身編碼的mRNA，因此為了提高MazF的表達量，我們對mazF基因中的9個ACA位點進行同義突變。克隆至pET28a載體中，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌BL21菌株中，篩選出陽性克隆并測序正確。IPTG誘導后經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在約13kDa處能觀察到MazF的表達。誘導表達的蛋白經(jīng)Ni-NTA柱純化后作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得MazF蛋白的多克隆抗血清，通過免疫印跡法分析，證實MazF多克隆抗血清制備