Graves病患外周血miR-346的變化及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的:
　　 通過研究Graves病(Graves'disease，GD)患者外周血中miR-346表達水平的變化，分析miR-346與濾泡輔助性T淋巴細胞(follicularhelperTcell，Tfhcell)以及病人自身抗體水平的關(guān)系，初步探討miR-346在Tfh細胞分化以及Graves病發(fā)病過程中的作用。
　　 方法:
　　 1.通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測GD患者與健康對照外周血C

2、D4+T細胞中Bcl-6mRNA表達情況。利用miRanda和PicTar兩個數(shù)據(jù)庫軟件，預(yù)測可能調(diào)控Bcl-6的miRNAs，通過qRT-PCR檢測這些miRNAs在GD患者以及健康對照CD4+T細胞中的表達情況，篩選出與Bcl-6mRNA表達趨勢相反的miRNA做進一步研究。
　　 2.利用熒光素酶報告實驗驗證miR-346與Bcl-6的靶向作用，明確miR-346與Bcl-63'UTR的兩個結(jié)合位點的作用強度。以表達Bcl

3、-6的Jurkat細胞做為模型，轉(zhuǎn)染miR-346mimics或NC，通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后Jurkat細胞Bcl-6mRNA水平變化，Western-blot檢測Jurkat細胞Bcl-6蛋白水平變化。
　　 3.磁珠分選健康人外周血CD4+T細胞，轉(zhuǎn)染miR-346mimics或NC，采用流式細胞術(shù)(flowcytometer,FCM)檢測轉(zhuǎn)染后CD4+T細胞中Tfh細胞(CD4+CXCR5+T)的比例變化。
　

4、　 4.采用qRT-PCR檢測GD患者、治療后GD組以及健康對照者的外周血CD4+T細胞以及血漿中成熟miR-346表達情況，并進行比較。
　　 5.采用流式細胞術(shù)檢測GD患者外周血中Tfh細胞(CD4+CXCR5+T)的比例，并與CD4+T細胞以及血漿中成熟miR-346表達水平進行相關(guān)性分析。同時對GD患者外周CD4+T細胞中miR-346表達水平與Bcl-6mRNA水平進行相關(guān)性分析。
　　 6.應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫

5、分析法(chemiluminescenceimmunoassay,CIA)檢測GD患者的抗促甲狀腺激素受體抗體(anti-TSHreceptorantibody,TR-Ab)、抗甲狀腺球蛋白抗體（anti-thyroglobulinantibody,TG-Ab）和抗甲狀腺過氧化物酶抗體（anti-thyroperoxidaseantibody,TPO-Ab）的水平，分析三種抗體水平分別與外周CD4+T細胞中miR-346表達水平的相關(guān)性

6、。
　　 結(jié)果:
　　 1.GD患者外周血CD4+T細胞中Bcl-6mRNA水平顯著升高(P＜0.05)。經(jīng)過miRanda和PicTar兩個數(shù)據(jù)庫軟件的分析，取預(yù)測結(jié)果的交集，并結(jié)合文獻查詢結(jié)果，篩選出可能調(diào)控Bcl-6的miRNA:miR-181d，miR-20a，miR-30b，miR-346。只有miR-346在GD患者外周血CD4+T細胞中表達顯著下調(diào)(P＜0.05)，與上調(diào)的Bcl-6mRNA水平趨勢相反。<

7、br>　　 2.熒光素酶報告實驗證實，miR-346通過與Bcl-6的3'UTR上第576-582位堿基及第893-899位堿基互補結(jié)合發(fā)揮抑制功能。miR-346單獨作用于576-582位點時，熒光素酶活性下降約42％;單獨作用于893-899位點時，熒光素酶活性下降約30％;同時作用于兩位點時，熒光素酶活性下降約60％。Jurkat細胞（人白血病T細胞）自然狀態(tài)下表達Bcl-6，過表達的miR-346能夠從mRNA水平和蛋白水平抑

8、制其Bcl-6的表達。
　　 3.與轉(zhuǎn)染NC組相比，人外周血CD4+T細胞過表達miR-346后，CD4+CXCR5+T細胞的比例明顯下調(diào)。
　　 4.與健康對照組相比，GD組外周血CD4+T細胞和血漿中miR-346表達水平明顯下調(diào)(P＜0.001;P＜0.001)，治療后GD組外周血CD4+T細胞和血漿中miR-346表達水平有所恢復(fù)。
　　 5.GD患者CD4+T細胞中miR-346水平與CD4+CXCR5

9、+T細胞的比例呈負相關(guān)(r=-0.4771，P=0.0334)，與Bcl-6mRNA水平也呈負相關(guān)（r=-0.4558，P=0.0434）。GD患者血漿miR-346水平與外周血中CD4+CXCR5+T細胞的比例有負相關(guān)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(r=-0.3322,P=0.1647)。
　　 6.GD患者血清TR-Ab、TG-Ab和TPO-Ab水平分別與外周CD4+T細胞中miR-346表達水平呈負相關(guān)(r=-0.4086，P=0.

10、0202;r=-0.4368，P=0.0227;r=-0.3533,P=0.0473)
　　 結(jié)論:
　　 1.通過生物信息學(xué)預(yù)測以及臨床標(biāo)本初篩，選出可能調(diào)控Tfh細胞主要轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6的miRNA，miR-346;通過熒光素酶報告實驗證實miR-346靶向作用于Bcl-6，主要作用位點是Bcl-63'UTR上第576-582位堿基及第893-899位堿基;使Jurkat細胞過表達miR-346，證實miR-346