MiR-346對Graves病小鼠Tfh細(xì)胞影響的初步研究.pdf

1、目的：
　　利用重組腺病毒載體AdE-GFP-hTSHR289誘導(dǎo)小鼠GD模型，并初步探討miR-346對GD小鼠Tfh細(xì)胞的影響。
　　方法：
　?。?）利用電轉(zhuǎn)化的方法將腺病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BJ5183中，獲得含有腺病毒骨架質(zhì)粒的E.coli BJ5183(E. coli BJ5183-p)，之后將E. coli BJ5183-p制備成化學(xué)感受態(tài)。
　?。?）利用限制性內(nèi)切酶技術(shù)將hTSHR2

2、89插入攜帶GFP基因的pAdTrack-CMV中，然后將重組后的質(zhì)粒 pAdTrack-hTSHR289轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BJ5183-p，利用E.coli BJ5183的重組酶活性，腺病毒骨架質(zhì)粒和 pAdTrack-hTSHR289實現(xiàn)同源重組，得到了攜帶有目的基因的重組腺病毒骨架質(zhì)粒（pAdEasy-GFP-hTSHR289），進(jìn)一步將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli DH5α中，制備大量拷貝的腺病毒質(zhì)粒。PacI酶切p

3、AdEasy-GFP-hTSHR289，將其轉(zhuǎn)染到人胚腎293A細(xì)胞，1-2天后，倒置熒光顯微鏡下可見293A細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，初步判斷其轉(zhuǎn)染效率。
　?。?）大量擴(kuò)增重組的腺病毒，TCID50法檢測重組腺病毒滴度。在第0、3、6周通過肌肉注射腺病毒免疫刺激雌性BABL/c小鼠。于第10周取小鼠眼球血，ELISA方法檢測小鼠血清TRAb和T4水平，同時取甲狀腺組織做病理學(xué)檢查。
　　（4）流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟和頸部淋巴

4、結(jié)Tfh細(xì)胞比例。
　　II
　?。?）第0、4、8、12、16天，尾靜脈注射miR-346到GD小鼠體內(nèi)，于第18天處死小鼠，ELISA方法檢測小鼠血清TRAb和T4水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞的比例，并與對照小鼠進(jìn)行比較。
　　結(jié)果
　?。?）通過酶切，轉(zhuǎn)接和測序驗證，得到重組質(zhì)粒pAdEasy-GFP-hTSHR289，通過人胚腎293A細(xì)胞包裝得到了重組腺病毒（AdE-GFP-hTSHR

5、289）。
　?。?）重組腺病毒具有高滴度和高感染性，TCID50法測得AdE-GFP-hTSHR289的滴度為3.5×109 pfu/ml，AdE-GFP-CMV的滴度為2.4×109 pfu/ml；ELISA結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，腺病毒AdE-GFP-hTSHR289處理組小鼠，80％的血清中TRAb水平明顯升高（p<0.001），60%的血清T4水平升高（p<0.01）；甲狀腺病理切片顯示，實驗組小鼠的甲狀腺細(xì)胞輕度增

6、生，濾泡內(nèi)膠質(zhì)明顯減少。
　?。?）與對照組小鼠相比，GD小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞的比例是顯著增加的（p<0.05），而脾臟中則無顯著變化。
　　（4）GD小鼠在 miR-346干預(yù)后，與對照組相比，小鼠血清中TRAb和T4水平都出現(xiàn)顯著性降低（TRAb：p<0.05；T4：p<0.01）并且小鼠頸部淋巴結(jié)中Tfh細(xì)胞的比例也有所下降（p<0.05）。
　　結(jié)論
　　（1）利用Adeasy系統(tǒng)得到攜帶hTSHR