GRSF1介導(dǎo)miR-346上調(diào)hTERT表達(dá)的作用與機(jī)制研究.pdf

1、【目的】：微小RNA(microRNA，miRNA)是近十幾年來研究最廣泛、最明確的一類大小約22nt、內(nèi)源性的小非編碼RNA分子。其經(jīng)典的作用機(jī)制是成熟的miRNA組裝進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，種子序列依據(jù)與靶基因mRNA非翻譯區(qū)的配對(duì)程度決定mRNA降解還是翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。但是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)基

2、因的表達(dá)，這依賴于miRNA與靶mRNA序列的特異性相互作用，并且與miRNA核糖核蛋白復(fù)合體(microribonucleoprotein，microRNP)的具體成分及細(xì)胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)。另外，miRNA參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是復(fù)雜的，既可以通過一個(gè)miRNA調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNA的組合精細(xì)調(diào)控一個(gè)靶基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中，miR-138靶定人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomera

3、se reverse transcriptase，hTERT) mRNA3’UTR并負(fù)性調(diào)控其表達(dá)，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)；miR-346靶定并上調(diào)hTERT的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且miR-138和miR-346靶定hTERT mRNA3’UTR的同一區(qū)域，二者競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控hTERT mRNA，維持其異常高表達(dá)水平。本課題在此基礎(chǔ)上著重闡明miR-346結(jié)合hTERT mRNA3’UTR上調(diào)其表達(dá)的分子機(jī)制。
　　【方法】：首先，宮頸癌細(xì)

4、胞HeLa經(jīng)放線菌素D(actinomycin D，Act D)處理之后用定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hTERT mRNA的表達(dá)水平，確定miR-346在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控hTERT mRNA的表達(dá)。然后，用RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)miR-346/hTERT mRNA二聚體的可能二級(jí)結(jié)構(gòu)，深入分析miR-346的模序；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-346的其它候選靶基因，并預(yù)測(cè)與這些候選靶基因形成二聚體后miR-346暴露的模

5、序結(jié)構(gòu)，分別選取與miR-346雜交后暴露和不暴露類似miR-346/hTERT mRNA中miR-346模序的兩個(gè)靶基因。利用熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)分別研究miR-346對(duì)hTERT的調(diào)控是否受AGO2的影響、模序突變型miR-346對(duì)hTERT表達(dá)調(diào)控的影響以及miR-346對(duì)ACVR2B表達(dá)調(diào)控的影響。在HeLa細(xì)胞中用AGO2的抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(RNA IP，RIP)，qRT-P

6、CR檢測(cè)AGO2復(fù)合體中miR-346和hTERT mRNA的富集水平。同時(shí)，利用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模序突變型miR-346對(duì)細(xì)胞活性和生長(zhǎng)能力的影響。之后，將miR-138/hTERT mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中暴露出的“UGAA”模序突變?yōu)橐吧蚼iR-346的“CCGCAU”模序或突變型“AAAAUA”模序，western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變型miR-138對(duì)hTERT蛋白表達(dá)的影響。接下來，在HeLa細(xì)胞中單獨(dú)改變GRS

7、F1或同時(shí)改變GRSF1和野生型或模序突變型miR-346的表達(dá)水平，western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hTERT蛋白或ACVR2B蛋白表達(dá)水平的改變，從而分析GRSF1在miR-346上調(diào) hTERT和ACVR2B表達(dá)過程中的作用。隨后，利用RIP實(shí)驗(yàn)和RNA凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GRSF1與miR-346和/或hTERT mRNA的相互作用。進(jìn)一步

8、地，用蔗糖密度梯度離心實(shí)驗(yàn)分離和純化核糖體，qRT-PCR檢測(cè)核糖體組分中miR-346和hTERT mRNA的富集程度，分析miR-346是否募集hTERT mRNA到核糖體以及該過程是否由GRSF1介導(dǎo)。
　　【結(jié)果】：miR-346延長(zhǎng)hTERT mRNA的半衰期，增強(qiáng)hTERT mRNA的穩(wěn)定性。敲降A(chǔ)GO2不影響miR-346對(duì)含有hTERT3’UTR的綠色熒光蛋白報(bào)告基因和內(nèi)源性hTERT mRNA和蛋白的表達(dá)調(diào)控。A

9、GO2復(fù)合體中hTERT mRNA的富集水平與miR-138(陽性對(duì)照)的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，與miR-346的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)miR-346/hTERT mRNA二聚體的可能二級(jí)結(jié)構(gòu)，二者雜交后miR-346暴露出“CCGCAU”模序。突變miR-346的模序序列取消了野生型miR-346對(duì)報(bào)告基因和內(nèi)源性hTERT表達(dá)的促進(jìn)作用，解除了miR-346對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的促進(jìn)作用。另外，含有miR-34

10、6“CCGCAU”模序的miR-138促進(jìn)hTERT蛋白的表達(dá)，而含有miR-346突變型“AAAAUA”模序的miR-138抑制hTERT蛋白的表達(dá)。同時(shí)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-346的候選靶基因有142個(gè)，RNAhybrid軟件分析miR-346與候選靶基因雜交的可能二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終選取了其中兩個(gè)靶基因—activin A receptor，type IIB(ACVR2B)和SMAD family member3(SMAD3)，其

11、中，miR-346/ACVR2B mRNA二聚體暴露出miR-346的“CCGCAU”模序，而miR-346/SMAD3 mRNA二聚體則不暴露類似的模序結(jié)構(gòu)。miR-346靶定ACVR2B3’UTR并上調(diào)其的表達(dá)，同時(shí)，miR-346靶定SMAD33’UTR并負(fù)性調(diào)控其表達(dá)。模序突變型miR-346解除了野生型miR-346對(duì)ACVR2B的上調(diào)作用但不影響野生型miR-346對(duì)SMAD3的調(diào)控。hTERT蛋白和ACVR2B蛋白的表達(dá)水

12、平與GRSF1水平呈正相關(guān)關(guān)系；敲降GRSF1，miR-346上調(diào)hTERT和ACVR2B表達(dá)的能力減弱，含有miR-346“CCGCAU”模序的miR-138上調(diào)hTERT表達(dá)的能力減弱；突變miR-346的模序，GRSF1促進(jìn)hTERT和ACVR2B表達(dá)的能力減弱。miR-346和hTERT mRNA在GRSF1復(fù)合體中富集，而且GRSF1復(fù)合體中hTERT mRNA的富集程度與miR-346的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系。miR-346和

13、miR-346/hTERT mRNA3’UTR與GRSF1蛋白直接相互作用；miR-346模序突變后，該相互作用不存在。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-346和hTERT mRNA在核糖體組分中共分布；而且，miR-346促進(jìn)hTERT mRNA募集到核糖體，使其在核糖體組分中富集增加，分布曲線右移；突變miR-346的模序，hTERT mRNA在核糖體組分中富集減少，hTERT mRNA分布曲線左移。敲降GRSF1，miR-346介導(dǎo)的hTE