梓醇不同給藥方式藥動(dòng)學(xué)研究.pdf

1、地黃作為傳統(tǒng)四大懷藥之一，是常用的滋補(bǔ)類中藥，在中藥處方中使用廣泛。其主要活性成分梓醇具有防治癡呆、抗腦缺血、利尿、降血糖等多種生物活性，有較大的藥用價(jià)值。但現(xiàn)有文獻(xiàn)提示梓醇不同給藥途徑出現(xiàn)劑量效應(yīng)差異顯著，其原因尚未探明。本研究擬采用ALX致糖尿病模型，來驗(yàn)證不同途徑給予梓醇出現(xiàn)降糖作用是否出現(xiàn)劑量上的巨大差異;在此基礎(chǔ)上研究(1)胃腸理化環(huán)境（酸堿度）對(duì)梓醇穩(wěn)定性的影響;(2)肝微粒體酶對(duì)梓醇代謝的影響;(3)考察梓醇不同給藥途徑的

2、藥代動(dòng)力學(xué)差異。以期探索梓醇不同給藥途徑出現(xiàn)治療作用劑量差異的可能機(jī)制，為梓醇的后期成藥研究，如給藥途徑和劑型選擇等提供前期研究基礎(chǔ)。
　　第一部分:梓醇不同方式給藥下對(duì)ALX致糖尿病大鼠的治療作用
　　考察不同給藥方式下，梓醇對(duì)糖尿病大鼠治療作用的差異。正常組大鼠為隨機(jī)選取8只大鼠，普通飼養(yǎng)，不做任何處理。造模方法是大鼠在禁食不禁水的情況下喂養(yǎng)12小時(shí)后，采取兩步給藥法，腹腔注射新鮮配制的1％四氧嘧啶生理鹽水溶液制備糖尿病

3、模型:第1天一次性腹腔注射1％四氧嘧啶120 mg/kg，第2天一次性補(bǔ)注100 mg/kg。后經(jīng)過72 h的自由飲食后，禁食12h于眼眶取血用血糖儀測(cè)定血糖值，挑選血糖值大于16.7 mmol/L的大鼠作為糖尿病大鼠模型。均以500mg/kg二甲雙胍作為陽性對(duì)照藥物，藥物分為梓醇灌胃亞組(50、100、200mg/kg)和靜脈注射亞組(5、10、20mg/kg)，從造模成功后開始給藥，正常組和模型組大鼠靜脈注射相應(yīng)體積的生理鹽水，1次

4、/d，連續(xù)注射兩周?？疾扈鞔紝?duì)其血糖血脂水平和糖耐量的影響。結(jié)果表明，不同的給藥方式對(duì)降糖降脂效應(yīng)的劑量有明顯差異，灌胃給藥梓醇具有明顯降糖降脂作用的劑量為200 mg/kg;而靜脈注射梓醇5、10、20 mg/kg劑量均有明顯降糖降脂，改善糖耐量水平作用，呈明顯的量效依賴性。
　　第二部分:梓醇不同給藥劑量差異顯著原因探索
　　為了對(duì)梓醇不同方式給藥導(dǎo)致療效差異較大的原因進(jìn)行探討，我們對(duì)梓醇在不同PH條件下的穩(wěn)定性，肝微粒

5、體代謝，梓醇不同方式給藥的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究。
　　實(shí)驗(yàn)一胃腸理化環(huán)境（酸堿度）對(duì)梓醇穩(wěn)定性的影響
　　考察梓醇在酸堿環(huán)境中的化學(xué)穩(wěn)定性，使梓醇在PH值分別為1、2、3、5、7.4、9、12的溶液，37℃條件下保留，并14h取樣測(cè)定梓醇濃度變化情況。SD大鼠，禁食36h，用3.5％水合氯醛麻醉，剪開腹部肌肉，暴露胃，于賁門處插管并結(jié)扎賁門，于幽門處插管并結(jié)扎幽門，用去胃蛋白酶的人工胃液5ml洗滌大鼠胃2次后，于胃中注入5ml人工

6、胃液保留2h，取樣測(cè)定梓醇濃度變化情況;SD大鼠，禁食36h，用3.5％水合氯醛麻醉，剪開腹部肌肉，暴露腸道，于屈氏韌帶下10cm，距回盲部上10cm插管并結(jié)扎。用人工腸液20ml洗滌大鼠腸道2次，于腸中注入10ml人工腸液保留2h，取樣測(cè)定梓醇濃度變化情況。結(jié)果表明梓醇在PH為1，2，3時(shí)，較不穩(wěn)定。隨著時(shí)間的變化，呈線性下降趨勢(shì)，酸度越高，下降越快。當(dāng)PH＞5時(shí)，隨時(shí)間變化不大。PH為堿性時(shí)，梓醇濃度也無明顯變化。說明梓醇在酸性環(huán)境

7、下易破壞，在堿性條件下相對(duì)穩(wěn)定。梓醇在灌胃人工胃液中的濃度變化顯示:隨著時(shí)間的變化，梓醇濃度下降明顯，呈現(xiàn)線性下降趨勢(shì);梓醇在灌腸人工胃液中的濃度變化顯示:隨著時(shí)間的變化，梓醇濃度下降明顯，呈現(xiàn)線性下降趨勢(shì)，但下降速度不如在灌胃保留液中明顯。
　　實(shí)驗(yàn)二梓醇在肝微粒體酶中的代謝情況
　　考察梓醇在肝微粒體酶中的代謝情況，了解肝微粒體酶對(duì)梓醇的穩(wěn)定性的影響。整個(gè)肝微粒體孵化體系約0.5ml，其中緩沖體系為0.1mol/L Tr

8、is-HCl緩沖溶液(PH=7.4)，梓醇10 mg/L，肝微粒體蛋白1g/L，MgCl210mmol/L，KCl10mmol/L，系統(tǒng)37℃水浴5min，加入同樣預(yù)熱的反應(yīng)啟動(dòng)液NADPH1mmol/L開始，于水浴反應(yīng)30min，取出放入冰浴終止反應(yīng)。并對(duì)反應(yīng)時(shí)間，蛋白濃度，梓醇濃度做了篩選，得到最優(yōu)反應(yīng)條件;選出最優(yōu)條件后通過底物消除法對(duì)酶促動(dòng)力參數(shù)Km、Vmax和CLint進(jìn)行了測(cè)定;最后測(cè)定CYP450酶亞型專屬性抑制劑對(duì)梓醇代

9、謝的抑制作用以及抑制作用大小，鑒別出參與梓醇的代謝的CYP450酶亞型。梓醇在0～60min孵育，其中0～30min內(nèi)線性較好;梓醇在蛋白濃度為0.2～2.0g/L范圍內(nèi)孵育，梓醇在蛋白濃度0.2～1g/L范圍內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度增加，梓醇消除線性增加，所以梓醇在微粒體中孵育蛋白濃度確認(rèn)為1.0g/L;不同濃度的梓醇(濃度2～100mg/L)在蛋白濃度為1.0g/L的微粒體中孵育30min，當(dāng)?shù)孜餄舛龋?0mg/L時(shí)，梓醇的代謝速率開始減慢，

10、當(dāng)?shù)孜餄舛龋?0mg/L時(shí)，減慢比較明顯，所以梓醇在微粒體中的孵育的最佳濃度選取了10mg/L。通過底物消除法公式，繪圖計(jì)算后，得到梓醇在肝微粒體中的代謝Vmax為3.24mg/(L·min·mg)，Km為0.44mg/L，CLint為7.3mL/(min·mg)。結(jié)果表明，CYP2C19的特異性抑制劑噻氯匹啶在較低濃度(1.25μ mol/L)即對(duì)肝微粒酶對(duì)梓醇的代謝其抑制作用，且40μ mol/L抑制效果大于50％，為強(qiáng)效抑制劑;C

11、YP3A4的特異性抑制劑酮康唑在0.1μmol/L即可對(duì)梓醇代謝其顯著抑制作用且4μmol/L時(shí)抑制效果大于50％，為強(qiáng)效抑制劑。CYP2D6的特異性抑制劑奎尼丁在1μmol/L時(shí)也表現(xiàn)出對(duì)梓醇代謝的抑制作用，20μ mol/L時(shí)抑制效果在20～50％之間，為中效抑制劑。而其他藥物對(duì)梓醇的代謝無顯著影響，即梓醇主要通過CYP2C19，CYP3A4，CYP2D6發(fā)生代謝作用。
　　實(shí)驗(yàn)三考察梓醇不同給藥途徑（肌注，灌胃，靜注）的藥代

12、動(dòng)力學(xué)差異
　　研究梓醇在不同給藥途徑（肌注，灌胃，靜注）的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異。取SPF級(jí)SD大鼠18只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，隨機(jī)分為3組，分別進(jìn)行灌胃，后腿肌肉注射，尾靜脈注射給藥，給藥劑量50 mg·kg-1，于給藥前(0 min)和給藥后2、5、15、30、60、120、180、300、480、600 min，眼眶動(dòng)脈采血，血樣經(jīng)處理后進(jìn)行HPLC分析。將所得的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，用DAS3.5中統(tǒng)計(jì)矩方法求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

13、。結(jié)果表明，梓醇在口服，肌注和靜注后，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)顯示，口服半衰期（t1/2z=1.39±0.22 h）顯著長(zhǎng)于肌注(t1/2z=0.84±0.41 h)和靜注(t1/2z=0.68±0.24 h)，這可能是口服吸收時(shí)間較長(zhǎng)所致。口服梓醇體內(nèi)滯留時(shí)間MRT為3.23±0.37 h，長(zhǎng)于肌注MRT(1.62±0.20h)和靜注MRT(1.71±0.29 h)，和靜注比具有顯著性差異(P＜0.01)。肌肉注射吸收迅速，Tmax為0.25±0.

14、1 h顯著短于口服1.66±0.58 h。一般認(rèn)為，大鼠Vz/F小于5L指藥物主要分布于血漿，所以口服1.17±0.16L/kg，肌注Vz/F為0.40±0.20 L/kg，靜注Vz/F為0.57±0.19 L/kg，都代表藥物主要分布于血漿。肌注生物利用度為71.63％大于口服的49.38％。梓醇在胃腸道不穩(wěn)定，但是其灌胃生物利用度接近50％，這結(jié)果和梓醇灌胃和靜脈注射治療糖尿病療效相差近10倍有差異，原因可能和梓醇在體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)