間充質(zhì)干細(xì)胞通過外泌體攜帶mir-223來調(diào)控巨噬細(xì)胞極化從而促進(jìn)皮膚缺損的愈合.pdf

1、口腔頜面部缺損的整復(fù)已成為修復(fù)重建外科及其相關(guān)學(xué)科的重要任務(wù)。各種計(jì)算機(jī)輔助手術(shù)的新技術(shù)及修復(fù)替代材料及組織工程學(xué)研究的不斷深入為頜面部缺損修復(fù)重建提供了更多的技術(shù)支持。大量研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）有修復(fù)、再生和免疫調(diào)節(jié)功能。相關(guān)研究初步明確了系統(tǒng)注射 MSCs(包括骨髓MSCs和頜骨MSCs)可歸巢到皮膚缺損處，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向具有組織重構(gòu)功能的M2型巨噬細(xì)胞極化，從而促進(jìn)皮膚缺損愈合。然而對于MSCs是如何調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)

2、制還未做相關(guān)報(bào)道，細(xì)胞與細(xì)胞間溝通的重要物質(zhì)外泌體(exosome)在其中所起的作用也沒有闡述清楚。明確MSCs與巨噬細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系及其中的機(jī)制有利于我們更深刻的理解 MSCs在皮膚缺損修復(fù)中對病理過程的潛在影響，從而在臨床上為皮膚缺損愈合的治療手段提供新思路。
　　目的:
　　本研究旨在探討間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow Mesen

3、chymal stem cells，BMMSCs)和頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ orofacial bone marrow derived MSCs,OMMSCs）來源的外泌體（exosome）的特性及以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為例探討間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化以促進(jìn)傷口愈合中發(fā)揮的作用的機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分：（1）；骨髓穿刺法和密度梯度離心法培養(yǎng)長骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ BMMSCs），體外組織塊培養(yǎng)法和有限稀釋

4、法培養(yǎng)頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（OMMSCs），檢測其克隆形成及多向分化能力，確定其干細(xì)胞特性。（2）收集第4－6代 BMMSCs、OMMSCs上清液提取外泌體，應(yīng)用透射電鏡觀察其形態(tài)，蛋白印跡法檢測其表面特異標(biāo)志CD63、CD81，確認(rèn)并了解兩種干細(xì)胞來源的外泌體的特性。
　　第二部分：（1）MSCs來源的exosome與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞( peripheral blood mononuclear cells，PBMNC)來源

5、巨噬細(xì)胞作用24 h后用共聚焦顯微鏡觀察其與巨噬細(xì)胞的作用方式。將細(xì)胞分為PBS組A1組（control組）、BMMSCs組B1組（BMMSCs組）、BMMSCs來源的exosome組C1組（BMMSC-Ex組）、SiRab27a轉(zhuǎn)染的BMMSCs組D1組（ BM/SiRab27a組）與巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)后,用流式細(xì)胞儀與細(xì)胞免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞M1、M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志的變化，RT-RCR檢測 M1/M2型相關(guān)基因表達(dá)變化。（2）建

6、立小鼠皮膚缺損模型（n=24只），隨機(jī)均分為對照組A2組（PBS組，I.V.，200μL），BMMSCs處理組 B2組（BMMSCs組，I.V.，2×106），BMMSCs來源 exosome處理組 C2組(BMMSC-Ex組,IV.,200ug)，Rab27a SiRNA轉(zhuǎn)染BMMSCs抑制exosome分泌組D2組（BM/siRab27a組，I.V.，2×106）觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組皮膚缺損愈合情況并進(jìn)行組織切片的蘇木素伊紅（Hema

7、toxylin andE，HE）、免疫組織化學(xué)及Masson特殊染色，比較不同組別皮膚缺損愈合效率及血管生成，炎細(xì)胞浸潤，膠原纖維形成等各項(xiàng)皮膚缺損愈合的指標(biāo)。通過細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR和 Western Blot觀察各組小鼠皮膚缺損愈合處的M2型巨噬細(xì)胞與M1型巨噬細(xì)胞的狀況。
　　第三部分：（1）實(shí)時(shí)定量 PCR檢測 exosome內(nèi)免疫相關(guān) miR-223和miR-let-7c表達(dá)，及exosome與巨噬細(xì)胞作用72 h

8、后巨噬細(xì)胞中microRNA表達(dá)。(2)將miR-223過表達(dá)與抑制后的MSC-Ex與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞儀與細(xì)胞免疫熒光檢測巨噬細(xì)胞M1、M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志的變化。
　　結(jié)果:
　　1、BMMSCs、OMMSCs具有較高的自我更新能力及成骨成脂分化能力，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　2、兩種充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體近似圓形，直徑在60－120 nm之間，表達(dá)表面標(biāo)志CD63、CD81。
　　3、B

9、MMSCs來源的exosome可被巨噬細(xì)胞攝取并分布在細(xì)胞核周圍，流式細(xì)胞儀、細(xì)胞免疫熒光檢測顯示與BMMSCs組、BMMSC-Ex組表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD206的巨噬細(xì)胞比例較PBS組上升；且抑制BMMSCs的exosome分泌后表達(dá) M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志 CD206的巨噬細(xì)胞比例下降；RT-PCR檢測BMMSCs組、BMMSC-Ex組的巨噬細(xì)胞表達(dá)M2型相關(guān)基因水平較PBS組高，且抑制BMMSCs的exosome分泌后表達(dá)M2型相

10、關(guān)基因水平下降與PBS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、B2（BMMSCs）組、C2（BMMSC-Ex）組兩組小鼠皮膚缺損的愈合效率明顯快于PBS組且D2組（BM/SiRab27a）小鼠皮膚缺損的愈合效率與PBS組無明顯差異；HE染色顯示B2、C2兩組傷口缺損較A2組少，D2與A2無明顯差異；Masson三色染色顯示，B2、C2組形成的藍(lán)色纖維較A2組多且方向更整齊；D2與A2無明顯差異B2、C2兩組的增殖細(xì)胞核抗原（Prolifer

11、ative Cell Nuclear Antigen，PCNA）和CD31陽性細(xì)胞多于A2組，D2與A2無明顯差異。細(xì)胞免疫熒光、RT-PCR和Western Blot結(jié)果均顯示B2、C2組兩組小鼠皮膚缺損愈合處的M2型巨噬細(xì)胞明顯多于A2組，且D2、A2組無明顯差異。
　　5、BMMSCs來源的 exosome內(nèi)含有與巨噬細(xì)胞調(diào)控相關(guān)的 microRNA如miR-223和 miR-let-7c等，能被巨噬細(xì)胞吞噬，BMMSCs-

12、Ex與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)72h后與對照組相比巨噬細(xì)胞中miR-223含量增加。
　　6、過表達(dá)mir-223的exosome與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀、細(xì)胞免疫熒光檢測顯示M2型巨噬細(xì)胞比例較PBS組上升，而抑制mir-223表達(dá)后與PBS無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.OMMSCs與 BMMSCs均有干細(xì)胞特性，在一定條件下同樣也是合適的種子細(xì)胞且均可分泌exosome。
　　2、MSCs來源exosome可在