復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程皮膚的構(gòu)建及其促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）是干細(xì)胞與組織工程領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)，BMMSCs 是一種可以多向分化的成體干細(xì)胞，具有取材方便，易分離培養(yǎng)，增殖能力強(qiáng)，來(lái)源于自體無(wú)排斥反應(yīng)的特點(diǎn)。 近年來(lái)，盡管已成功應(yīng)用自體成熟細(xì)胞如成纖維細(xì)胞來(lái)修復(fù)皮膚缺損，但BMMSCs 與這些分化的細(xì)胞相比具有更大的優(yōu)勢(shì)。因?yàn)锽MMSCs 是中胚層來(lái)源的干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，BMMSCs 可以保持未分化表型不斷增殖，達(dá)到所需數(shù)量，再經(jīng)誘導(dǎo)可分化為所

2、需表型；另外，BMMSCs 易于從骨髓中分離獲得，避免了通過(guò)手術(shù)從患者自身獲取成熟細(xì)胞所造成的二次損傷。 本研究在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng)了組織工程皮膚的種子細(xì)胞：角朊細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；建立皮膚損傷動(dòng)物模型：直接切除模型和燒傷模型；用構(gòu)建的組織工程全層皮膚和含BMMSCs 的組織工程真皮修復(fù)損傷模型，觀察修復(fù)效果，為構(gòu)建具有生理功能的組織工程皮膚奠定基礎(chǔ)。 第一部分：種子細(xì)胞的培養(yǎng) 以免疫原性較低的新

3、生豬背部皮膚為取材對(duì)象，Dispase酶消化過(guò)夜仔細(xì)分離表皮層和真皮層，表皮層用胰酶消化后得到的細(xì)胞用角朊細(xì)胞培養(yǎng)基（K-SFM）培養(yǎng)；真皮層剪碎用膠原酶消化后得到的成纖維細(xì)胞用4種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，MTT和BrdU檢測(cè)活力。角朊細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在體外生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖快，呈典型的鋪路石樣和長(zhǎng)梭形。從豬髂骨處抽取骨髓，本實(shí)驗(yàn)采用Percoll密度梯度離心法與貼壁篩選法相結(jié)合分離純化BMMSCs，多次傳代后的BMMSCs為形態(tài)均一、排列有序

4、的成纖維細(xì)胞樣，提示傳代過(guò)程對(duì)純化骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的BMMSCs有一定作用。豬BMMSCs在體外條件下生長(zhǎng)穩(wěn)定，傳代后仍保持良好的狀態(tài)，有分化的潛能，可作為組織工程皮膚的種子細(xì)胞。 第二部分：組織工程皮膚的研制 將成纖維細(xì)胞種植入Ⅰ型膠原凝膠中，培養(yǎng)3 d 后，將表皮細(xì)胞接種在凝膠的表面，繼續(xù)培養(yǎng)2 d ，然后將凝膠移至氣液面進(jìn)行復(fù)層化3 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的人工皮膚具備表皮層和真皮層，其結(jié)構(gòu)和正常皮膚的結(jié)構(gòu)相似。

5、 證明了以新生豬皮膚為細(xì)胞來(lái)源、Ⅰ型膠原為支架構(gòu)建的全層組織工程皮膚，在組織學(xué)上與皮膚組織結(jié)構(gòu)相類似，可以作為皮膚替代物。體外培養(yǎng)并擴(kuò)增豬BMMSCs，用PKH26 熒光染色試劑盒進(jìn)行熒光標(biāo)記，將標(biāo)記好的細(xì)胞種植入Ⅰ型膠原凝膠中，培養(yǎng)3 d 后后將凝膠移至氣液面繼續(xù)培養(yǎng)2 d。光鏡下可見(jiàn)與正常皮膚的真皮部分相似，表皮層缺如，真皮層較厚，但組織工程皮膚中缺少毛囊、汗腺和血管結(jié)構(gòu)等。熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)，在真皮層中富含PKH26 標(biāo)記的細(xì)

6、胞（胞膜呈紅色熒光）。 第三部分：組織工程皮膚修復(fù)動(dòng)物皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究 用構(gòu)建的組織工程全層皮膚和含BMMSCs 的組織工程真皮修復(fù)動(dòng)物的急性切除模型，觀察創(chuàng)面愈合情況。TE 全層組和BMMSCs 組在皮片成活率和創(chuàng)面收縮率上無(wú)明顯差異，HE、Masson、網(wǎng)狀纖維和PAS 染色觀察組織學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)BMMSCs 組具有良好的組織相容性和生物學(xué)活性，與受者愈合良好，未見(jiàn)顯著的免疫排斥反應(yīng)。用實(shí)驗(yàn)室自行研制的燙傷儀，根據(jù)

7、調(diào)整燙頭和皮膚接觸的時(shí)間和溫度，調(diào)節(jié)燙傷儀至：溫度100℃，時(shí)間20 s，模擬深Ⅱ度燙傷模型。用組織工程全層皮膚和復(fù)合BMMSCs（PKH26 標(biāo)記）的組織工程真皮修復(fù)燙傷創(chuàng)面，移植2 wk 后實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面基本愈合，TE 全層組和BMMSCs 組的愈合時(shí)間、效果沒(méi)有差異。BMMSCs 組真皮層毛細(xì)血管增生，6 wk 時(shí)仍可檢測(cè)到紅色熒光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，免疫組織化學(xué)染色顯示角蛋白和Ⅰ型膠原表達(dá)陽(yáng)性。含有BMMSCs 的組織工程皮膚移植