miR-124對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移的調(diào)控研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種多能成體干細(xì)胞，其來源充足，容易擴(kuò)增，免疫原性低，具有自我更新和多向分化潛能，很多研究表明MSCs可遷移至損傷或病變部位修復(fù)組織損傷，成為細(xì)胞治療理想的種子細(xì)胞。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，MSCs受到特定的細(xì)胞趨化因子(HGF、SDF、VEGF)或炎癥信號(hào)的作用定向遷移至受損或炎癥部位。但研究發(fā)現(xiàn)只有少量的MSCs可遷移至損傷區(qū)域，因此提高M(jìn)SCs的定向遷移能力，增加遷

2、移到損傷部位的移植細(xì)胞的數(shù)量至關(guān)重要，然而影響和控制這一趨化過程的分子機(jī)制還知之甚少。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約20-24 nt的非編碼RNA，通過與信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)（3'untranslated regions，3'UTRs）結(jié)合，使mRNA降解或者抑制靶基因的翻譯從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。隨著miRNAs的深入研究，越來越多的證據(jù)表明miRNAs對(duì)胚胎發(fā)育，細(xì)胞增殖，遷移和分化

3、等具有重要的調(diào)控作用。然而關(guān)于miRNA參與調(diào)控MSCs的遷移還鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-124對(duì)MSCs定向遷移以及遷移相關(guān)通路Wnt/β-catenin信號(hào)的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明HGF能夠誘導(dǎo)MSCs的趨化性遷移，50 ng/ml HGF處理，細(xì)胞的遷移總數(shù)達(dá)到最大值。因此首先采用50 ng/ml的HGF刺激MSCs不同時(shí)間點(diǎn)(0h、0.5h、2h、5h、12h、24 h)，Q-PCR檢測(cè)miR-124的表達(dá)

4、變化，結(jié)果顯示HGF處理MSCs0.5 h，12h和24 h后，miR-124的表達(dá)顯著下調(diào)，推測(cè)miR-124參與負(fù)向調(diào)控MSCs向HGF的趨化性遷移。接著在MSCs中轉(zhuǎn)染miR-124 mimic，使miR-124高表達(dá)，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Boyden chamber實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-124對(duì)MSCs遷移的影響，結(jié)果表明miR-124可顯著抑制MSCs的定向遷移。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，采用miR-124抑制劑下調(diào)MSCs中miR-12

5、4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制miR-124促進(jìn)劃痕的愈合，顯著促進(jìn)MSCs向HGF的趨化性遷移。接著研究miR-124調(diào)控MSCs遷移的分子機(jī)制，通過Targetscan靶基因預(yù)測(cè)軟件分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞遷移相關(guān)的兩個(gè)基因FZD4和LRP6很可能是miR-124的靶基因。為了驗(yàn)證FZD4和LRP6是否為miR-124的直接靶基因，我們克隆了含有兩個(gè)miR-124保守結(jié)合位點(diǎn)的FZD43'UTR片段以及LRP6的3'UTR全長(zhǎng)序列，并使用PCR定點(diǎn)突變

6、的方法將miR-124的靶位點(diǎn)突變失活，從而獲得野生型以及突變型的FZD4和LRP6雙熒光素酶報(bào)告基因載體。使用上述載體進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果表明miR-124確實(shí)能夠通過與FZD4和LRP6的3'UTR結(jié)合調(diào)節(jié)這兩個(gè)基因的表達(dá)。此外通過Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-124可顯著下調(diào)FZD4的mRNA水平，雖然LRP6在mRNA水平也下調(diào)，但無顯著性差異。Western blot實(shí)驗(yàn)證明在MSCs中高表達(dá)miR-124能夠

7、下調(diào)FZD4及LRP6蛋白的表達(dá)。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路不僅影響腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，對(duì)干細(xì)胞的維持，增殖和遷移同樣具有重要的作用。LRP6為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的輔受體，可以通過胞外區(qū)結(jié)合Wnt蛋白和Frizzled(FZD)受體共同作用使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)累積進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-124直接靶向FZD4和LRP6，因此檢測(cè)miR

8、-124對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。首先通過TOP/FOPFlash雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)高表達(dá)miR-124對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)的影響，使用Wnt3a處理激活Wnt/β-catenin信號(hào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-124可顯著抑制細(xì)胞中的TOPFlash報(bào)告基因活性，F(xiàn)OPFlash報(bào)告基因沒有明顯變化。免疫熒光染色結(jié)果顯示高表達(dá)miR-124抑制β-catenin的入核，而抑制miR-124能夠促進(jìn)β-

9、catenin的入核。Western blot結(jié)果顯示在MSCs中高表達(dá)miR-124，p-β-catenin蛋白水平上調(diào)，ABC(activatedβ-catenin)蛋白水平降低;當(dāng)抑制miR-124時(shí)ABC的蛋白水平升高，而p-β-catenin蛋白水平降低。此外，研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-124顯著抑制Wnt/β-eatenin信號(hào)通路下游靶基因RUNX2和c-Myc的表達(dá)。以上這些結(jié)果說明miR-124能夠抑制Wnt/β-cate

10、nin信號(hào)通路。
　　為了進(jìn)一步研究miR-124調(diào)控MSCs的遷移是否與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)，我們使用Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活劑Wnt3a和抑制劑FH535，采用Boyden chamber進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)的研究。檢測(cè)結(jié)果顯示高表達(dá)miR-124顯著抑制了Wnt3a誘導(dǎo)的MSCs的遷移;而miR-124抑制劑對(duì)MSCs定向遷移的促進(jìn)作用會(huì)被FH535阻斷。以上結(jié)果表明miR-124可能通過調(diào)控W

11、nt/β-catenin信號(hào)通路影響MSCs的定向遷移。
　　細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜精密的過程，包括細(xì)胞前端偽足的伸出，粘著斑(focaladhesions，F(xiàn)As)的組裝和周轉(zhuǎn)以及細(xì)胞骨架的重排，因此我們最后檢測(cè)miR-124對(duì)粘著斑的數(shù)量，分布以及細(xì)胞骨架重排的影響。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在MSCs中高表達(dá)miR-124，粘著斑的數(shù)量減少，周邊/中央粘著斑的比例降低。且高表達(dá)miR-124干擾細(xì)胞片狀偽足的形成，細(xì)胞骨架F-actin