血管緊張素-Ⅱ預處理的人臍帶間充質干細胞促進皮膚全層組織缺損性創(chuàng)面愈合的機制研究.pdf

1、目的:
　　人臍帶間充質干細胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， hUCMSCs）作為一種較新型的 MSCs，其移植對于各類損傷的組織器官有良好的修復作用，因此也成為干細胞研究領域的熱點之一。但研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs移植后會受到機體內環(huán)境的影響，生物學特性發(fā)生改變，進而影響其修復效果。那么，如何能夠處理hUCMSCs，使其更適應機體內環(huán)境，發(fā)揮更好的組織修復作用是近來的研究

2、熱點，也是本研究的重點。損傷組織局部微環(huán)境中RAS系統(tǒng)的激活致使血管緊張素-II（Angiotensin-II，Ang-II）持續(xù)生成，影響著內、外源性MSCs的生物學活性及功能。有研究表明，高濃度Ang-II可誘導MSCs、人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelia cells，HUVEC）等多種細胞發(fā)生損傷、凋亡、甚至死亡，而低濃度Ang-II預處理MSCs后，則可顯著提高其耐缺氧能力，促進多種

3、細胞因子的分泌。在旁分泌的多種細胞因子中，血管內皮細胞因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是含量較高且發(fā)揮修復治療作用的關鍵因子，其通過與特異性受體（VEGFR2）結合，激活下游信號而發(fā)揮抗細胞凋亡、促細胞增殖以及新生血管生成的作用，進而修復重建各類損傷的組織器官。在前期實驗和查閱文獻的基礎上，本研究擬通過使用適宜濃度Ang-II預處理體外培養(yǎng)的hUCMSCs，再將預處理后的hUCMS

4、Cs（Ang-II-MSCs）移植于全層皮膚缺損動物模型，觀察其對創(chuàng)面修復重建的效果，以及深入研究Ang-II-MSCs促創(chuàng)面愈合的機制。從而為干細胞用于臨床治療多種創(chuàng)面提供的研究基礎。
　　方法：
　　(1) Ang-II對hUCMSCs生物學特性的影響：將培養(yǎng)的hUCMSCs隨機分為4組：0ng/mL Ang-II組（A組）、100ng/mL Ang-II組（B組）、500ng/mL Ang-II組（C組）和1000ng

5、/mL Ang-II組（D組）。倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和生長融合的情況；CCK8法檢測細胞的增殖情況；AO-EB染色法檢測細胞的凋亡情況；流式細胞儀檢測細胞的增殖周期和細胞的凋亡率。ELISA檢測上清液中VEGF、bFGF和HGF的含量。
　　(2) Ang-II預處理的hUCMSCs（Ang-II-MSCs）促進創(chuàng)面愈合的初步探索：實驗分為3組：將18-20kg雄性巴馬小型豬背部切取三個5cm×5cm大小的正方形的創(chuàng)面，制

6、備全層皮膚組織缺損模型。選取創(chuàng)面的9個點，通過局部注射的方式分別含有Ang-II-MSCs（1×107/1 mL ECM）、MSCs（1×107/1 mL ECM）Control（1mL ECM）的1ml培養(yǎng)基注入相應全層皮膚缺損模型創(chuàng)面。Image Pro Plus軟件評估各組創(chuàng)面的愈合率，記錄創(chuàng)面的愈合時間。組織化學染色檢測各組創(chuàng)面組織的整體結構、新生微血管的數量、膠原的排列情況以及角質蛋白K19（CK19）的表達情況。
　　

7、(3) Ang-II預處理后 hUCMSCs的上清液（Ang-II-CM）對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖、凋亡及血管形成的影響機制研究：首先將培養(yǎng)的 HUVEC分為3組：培養(yǎng)基組（CM）、MSCs條件培養(yǎng)基組（MSCs-CM）、100ng/mL Ang-II預處理后MSCs條件培養(yǎng)基組（Ang-II-CM），研究Ang-II-CM對HUVEC的增殖、凋亡的影響。選用1000ng/mL Ang-II致HUVEC損傷，制備凋亡模型。倒

8、置相差顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)；CCK8法檢測各組細胞的增殖情況；AO-EB、Hoechst染色法、流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況；Western Blot檢測各組細胞Caspase-3、bcl-2的表達情況，體外血管生成實驗檢測各組細胞血管形成能力。在 Ang-II-CM對 HUVEC的增殖、凋亡影響研究結果的基礎上，深入探討hUCMSCs旁分泌的VEGF對HUVEC的保護機制，本實驗繼續(xù)分為以下6組：siRNA-Control+C

9、M、siRNA-Control+MSCs-CM、siRNA-Control+Ang-II-CM、siVEGFR2+CM、siVEGFR2+MSCs-CM、siVEGFR2+Ang-II-CM。流式細胞儀檢測細胞的凋亡率；Western Blot檢測Caspase-3、bcl-2的表達情況；體外血管生成實驗檢測細胞的血管形成情況。
　　結果：
　?。?） Ang-II對hUCMSCs生物學特性的影響：與0 ng/mL組相比，5

10、00 ng/mL組和1000 ng/mL組中hUCMSCs的形態(tài)結構均發(fā)生改變，凋亡細胞的數目較多，增殖活性較低，上清中細胞因子水平也均較低，且1000 ng/mL組最為顯著。而100ng/mL組hUCMSCs形態(tài)和結構均正常，未見凋亡細胞或死亡細胞，且100ng/mL組細胞的增殖活性和分泌的細胞因子均顯著高于0 ng/mL組、500 ng/mL組和1000 ng/mL組。因此，我們篩選100ng/mL Ang-II進行預處理hUCMS

11、Cs。
　　（2） Ang-II預處理的hUCMSCs（Ang-II-MSCs）促進創(chuàng)面愈合的初步探索：在Control組、MSCs組和Ang-II-MSCs組中，Control組創(chuàng)面的愈合效果最差， Ang-II-MSCs組最好。三組創(chuàng)面的愈合時間分別為：55±3d、47±3d和40±3d， Ang-II-MSCs組創(chuàng)面的愈合時間最短。在35d時，三組創(chuàng)面的愈合率分別為(63±4)％、(75±4)%和(88±5)%，Ang-II

12、-MSCs組創(chuàng)面的愈合率最高，且該組創(chuàng)面組織的結構較完整，新生微血管數量較多、膠原排列更規(guī)整以及上皮化的程度更佳。
　　（3） Ang-II預處理后的 hUCMSCs上清液（Ang-II-CM）對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖、凋亡、新生血管影響的機制研究： Ang-II-CM對HUVEC增殖、凋亡、新生血管影響的研究結果表明，與 CM組相比， Ang-II-CM組與 MSCs-CM組中 HUVEC的形態(tài)和結構均較好，其中An

13、g-II-CM組凋亡細胞或死亡細胞最少，血管形成數量和細胞的增殖活性最好，MSCs-CM組次之。兩組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平均較CM組高，促凋亡蛋白Caspase-3的表達水平也較CM組低，而Ang-II-CM組則更為顯著。進一步使用siRNA干擾HUVEC中VEGFR2后，結果顯示：與siRNA-Control組相比，siVEGFR2組中Bcl-2表達量降低，Caspase-3表達量增高。此外，siVEGFR2組中凋亡細胞數量也

14、較siRNA-Control組顯著增加，而新生微血管的數量則顯著減少。因此，VEGF和 VEGFR2以及下游調控的Caspase-3和Bcl-2信號是hUCMSCs發(fā)揮促內皮細胞增殖、抗內皮細胞凋亡以及促內皮新生微血管的潛在機制。
　　結論：
　　綜上所述，適宜濃度（100ng/mL）Ang-II預處理的 hUCMSCs可促進其的增殖、減少凋亡，通過旁分泌高水平的VEGF，與內皮細胞上的VEGFR2結合，抑制下游的促凋亡蛋白