miR-223調控Lewis肺腺癌轉移性干細胞惡性表型的分子機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、肺癌是威脅人類健康的最常見惡性腫瘤,盡管放化療和手術方法不斷進展,但作為常見組織類型的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)總的5年生存率仍不足15%,其根本原因在于殘余腫瘤細胞對現(xiàn)有治療手段的抗拒。新近癌干細胞理論的建立給抗腫瘤治療提供新的研究方向。癌干細胞是腫瘤細胞中一個特殊的亞群,其突出特征是具有自我更新和不斷分化的能力,并與腫瘤細胞原發(fā)耐藥、新生血管形成乃至遠處轉移等腫瘤演進過程密切相關

2、。目前認為,癌干細胞具有獨特的惡性表型,與非癌干細胞有著不同的表面分子標志,在基因表達譜和蛋白質表達譜上也有較為顯著的差別。
   微RNA(MicroRNA,miRNA)是一類小的非編碼RNA,長度為18~25bp,它能通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)結合,抑制mRNA的翻譯或影響mRNA的穩(wěn)定性,在轉錄或轉錄后水平調控編碼蛋白基因的表達。組織或細胞在某個特定階段存在自身特異的miRNA表達譜,可作為其特征性分子

3、標志;關鍵miRNA參與干細胞自我更新、多向分化等特性的調控,并決定細胞的分化方向以及分化進程。因此,研究miRNA對肺癌干細胞惡性表型的調控作用,就可能提供有效治療肺癌的方法。
   目的:
   1.從小鼠Lewis lung carcinoma(LLC)細胞系中尋找Sca-1、CXCR4雙陽性細胞,并驗證其是否具有癌轉移性干細胞特性。
   2.比較細胞分化相關miRNA在CXCR4陽性與陰性LLC細胞中的

4、表達差異,并對差異表達顯著的miR-223進行生物信息學初步研究。
   3.將miR-223真核表達載體轉染至LLC細胞中,評價miR-223對LLC細胞惡性表型的調控作用及其分子機制。
   方法:
   1.流式分析Sca-1、CXCR4雙陽性細胞比例,激光共聚焦檢測小鼠肺癌組織中雙陽性細胞表達情況;以CXCR4作為磁珠分選細胞的表面標志,檢測分選前后細胞活性,觀察分析CXCR4陽性亞群的惡性生物學行為。<

5、br>   2.Trizol法抽提細胞總RNA,實時熒光定量PCR(TaqMan探針)檢測miRNAs表達,對表達差異最為顯著的miRNA進行潛在靶基因預測,應用RT-PCR、免疫組化方法初步分析具有研究價值的關鍵分子在兩個不同亞群細胞及移植瘤組織中的表達情況,并通過BLAST對其3'非翻譯端(3'-untranslated region,3'-UTR)進行直向同源基因序列比對分析。
   3.構建miR-223真核表達載體,

6、轉染后通過細胞劃痕、Transwell侵襲實驗觀察其對LLC細胞侵襲遷移能力的影響,流式細胞儀分析LLC細胞周期分布變化,ELISA檢測MMP9、VEGF表達水平,實時定量PCR、western blot檢測預測靶基因或通路蛋白表達情況。
   主要結果:
   1、LLC細胞中Sca-1、CXCR4雙陽性細胞比例為0.1%,CXCR4陽性細胞為0.18%,小鼠肺癌組織存在熒光雙染色細胞;分選前細胞活性為(95.58±0

7、.87)%,分選后活力為(94.96±0.76)%(P>0.05);CXCR4陽性亞群在無血清中呈球狀生長,CCK-8法顯示增殖能力明顯高于陰性亞群(P<0.05);CXCR陰性亞群1×105即不可成瘤,CXCR4陽性亞群在7×103仍可成瘤。
   2、CXCR4陽性LLC多毗鄰內皮細胞,周圍形成血管樣結構;CXCR4陽性LLC的VEGF mRNA表達(0.440±0.006)明顯高于CXCR4陰性LLC(0.290±0.00

8、3)(P<0.01);CXCR4陽性LLC移植瘤組織MVD(56.87±4.83),明顯高于CXCR4陰性LLC移植瘤(43.52±4.91)(P<0.01)。
   3、CXCR4陽性亞群組微膜下細胞數(shù)為109.67±20.03個,顯著高于CXCR4陰性亞群組的53.67±13.01個,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),CXCR4陽性亞群MMP9mRNA表達(0.622±0.014)明顯高于CXCR4陰性亞群(0.579±0

9、.017)(P<0.05);CXCR4陰性和陽性亞群分別以5×105、2×104密度各接種3只小鼠,前者無轉移,而后者2只發(fā)生肺轉移,1只發(fā)生耳轉移。
   4、CXCR4陽性與陰性LLC比較,具有對順鉑更強的抗拒性(P<0.05);CXCR4陽性LLC的ABCG2 mRNA表達(0.524±0.008)明顯高于CXCR4陰性LLC(0.387±0.007)(P<0.01)。
   5、CXCR4陽性與陰性LLC比較比較

10、,各檢測miRNA表達均較低,其中以miR-223差異最為顯著(Fold Change=8.26),通過軟件分析預測,miR-223與IGF1R、IGFBP5、Pik3cb、ELK-1和E2F1等基因均具有可能靶位點,CXCR4陽性LLC的IGF1R mRNA表達(0.421±0.007)明顯高于CXCR4陰性LLC(0.185±0.007)(P<0.01),免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)CXCR4+亞群種植瘤組織IGF1R表達顯著高于CXCR4陰性

11、亞群,IGF1R mRNA3'-UTR的238~244和688~695nt兩個結合位點具有高度的進化保守性。
   6、miR-223重組質粒轉染48小時后,細胞劃痕實驗顯示LLC細胞遷移(218.67±39.80μm),與正常對照組(341.67±35.92μm)比較,遷移能力顯著受抑(P<0.05);Transwell遷移實驗顯示微膜下細胞數(shù)為(60.67±12.66個),與正常對照組(100.33±14.01個)比較,侵襲

12、能力明顯下降(P<0.05);ELISA檢測MMP9濃度為(214.16±28.18pg/mL),與正常對照組(1139.14±50.13pg/mL)比較,差異非常顯著(P<0.01);流式細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)G0/G1細胞減少(53.8%→45.3%),G2細胞增加(4.29%→13.2%)。
   7、miR-223重組質粒轉染48小時后,實時定量PCR結果顯示IGF1R、CXCR4、CDK2等預測靶基因及MMP9 mRNA表達

13、分別下調大約17、12、25和15倍,與正常對照組比較,差異非常顯著(P<0.01);western blot結果顯示預測靶基因蛋白表達也明顯減少,IGF1R下游Akt、Erk信號通路明顯下調。
   結論:
   1、Lewis肺癌細胞中的CXCR4陽性亞群具有一定的自我更新和轉移能力,具備癌轉移干細胞某些特性,Sca-1、CXCR4可以作為小鼠肺腺癌轉移性干細胞的表面標志。
   2、miR-223在CXCR

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