慢病毒介導Sox9過表達和Fas干擾聯(lián)合轉染人退變髓核細胞的體外實驗研究.pdf

1、目的：復蘇低溫凍存的人退變髓核細胞，并觀察其活力；體外篩選最佳 Fas-siRNA并構建其慢病毒載體；Sox9、Fas及Sox9聯(lián)合Fas體外轉染人退變髓核細胞，并研究它們在體外對人退變髓核細胞的影響。
　　方法：復蘇液氮儲存的人退變椎間盤髓核細胞，對細胞進行培養(yǎng)，并觀察其活力情況。設計 Fas-siRNA-慢病毒載體，經酶切和基因測序鑒定重組克隆，對 Fas-siRNA進行慢病毒包裝，并檢測其滴度。將Sox9過表達和Fas干擾以

2、慢病毒為載體在體外聯(lián)合轉染人退變髓核細胞進行實驗研究，為了便于熒光顯微鏡觀察病毒轉染效率，用紅色熒光標記Sox9基因，藍色熒光標記Fas基因。實驗分為①空白對照組；②陰性對照組；③Sox9過表達組；④Fas干擾組；⑤Sox9過表達+Fas干擾組。攜帶目的基因的慢病毒轉染人退變髓核細胞72h后，通過熒光顯微鏡觀察，而檢測病毒轉染效率；CCK8檢測各組細胞增殖情況；RT-PCR檢測各組Sox9、Fas、Ⅱ型膠原、蛋白多糖在mRNA水平的表達

3、情況；Western-Blot分別檢測各組Ⅱ型膠原、蛋白多糖在蛋白質水平的表達。
　　結果：人退變髓核細胞成功復蘇培養(yǎng)后，細胞生長正常、狀態(tài)良好。經酶切及重組克隆基因測序鑒定顯示，應用基因重組技術成功構建Fas-siRNA慢病毒載體，檢測滴度大于1x108TU/ml。熒光顯微鏡觀察72h后③、④、⑤組的載體轉染人退變髓核細胞其轉染效率均達到80%以上。CCK8檢測結果顯示與①組相比②組細胞增殖變化不大，比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0

4、.05）；③組、④組、⑤組與①組相比細胞增殖率均有明顯增高，其中⑤組的細胞增殖率增高最為顯著，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。運用RT-PCR檢測方法證實在Sox9、Fas、Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA表達水平上①組與②組相比變化不大，比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；③組中Sox9的mRNA表達升高明顯，④組中Fas的mRNA表達水平降低明顯，⑤組中Sox9的mRNA表達水平升高最為顯著、Fas的mRNA表達水平降低最為顯著，

5、與①組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western-blot檢測結果表明與①組相比②組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達變化不明顯，比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；③組、④組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達均有明顯升高，⑤組升高最為顯著，與①組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：慢病毒介導的Fas-siRNA可以顯著抑制人退變髓核細胞中Fas基因的表達；上調Sox9基因的表達及沉默Fas基因的表達能夠增加人退變髓核細胞外基