腺相關病毒介導的CTGF和TIMP1雙基因聯(lián)合體外轉染人退變髓核細胞的生物學效應觀察.pdf

1、目的：構建人結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和基質金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metaUoproteinases 1，TIMP1)基因的腺相關病毒(adeno associated virus，AAV)雙表達重組質粒pSNAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1，體外檢測生物學活性后進行病毒包裝，并評價CTGF和TIMP1基因逆轉人腰椎

2、間盤退變的可行性。 方法：對構建的重組質粒pSNAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1進行PCR鑒定、酶切鑒定和測序，用脂質體介導重組質粒轉染人胚腎293(HEK293)細胞，通過雙重免疫熒光、Western blot、MTT法和ELISA等方法檢測細胞因子CTGF和TIMP1蛋白的生物學活性。在此基礎上進行病毒顆粒包裝。rAAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1感染體外分離培養(yǎng)并鑒定的人退變腰椎間盤髓核細胞，通過細

3、胞形態(tài)學觀察、氯胺T法、免疫組織化學法、<'35>S整合法以及Antonopoulos法等檢測CTGF和TIMP1對于人退變腰椎間盤髓核細胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成的影響。 結果：成功構建了含有完全正確的CTGF和TIMP1基因序列的AAV重組質粒。包裝出的具有生物學活性的rAAV<,2>-CTGF-IRES-TIMP1病毒能夠感染人退變腰椎間盤髓核細胞。CTGF和TIMP1聯(lián)合可以促進髓核細胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成。