牛SRY基因表達(dá)及其蛋白結(jié)合功能鑒定.pdf

1、奶牛是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的動(dòng)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)奶牛的性別控制必將大幅度的促進(jìn)經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，因此控制奶牛的性別顯得越來(lái)越重要。控制牛的性別主要決定于對(duì)性別形成機(jī)制的了解，Y染色體性別決定基因(Sex-determiningRegionontheYChromosome，SRY)被認(rèn)為是在性別決定調(diào)控級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的主基因，同時(shí)繆勒氏管抑制因子(MullerianInhibitingSubstance，MIS)也是哺乳動(dòng)物性別決定所必須的。MIS抑制繆勒氏管(構(gòu)

2、成雌性動(dòng)物的生殖結(jié)構(gòu))的形成，有研究表明MIS基因的表達(dá)可能是被SRY調(diào)節(jié)的。對(duì)于牛性別決定方面的研究很少，牛SRY是否對(duì)牛MIS基因的啟動(dòng)子有結(jié)合功能仍然不清楚，關(guān)于原核表達(dá)的牛SRY蛋白功能的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以牛SRY蛋白對(duì)MIS基因的表達(dá)是否有調(diào)控功能為研究目的，對(duì)牛SRY基因進(jìn)行了原核表達(dá)，克隆了牛、人、鼠的MIS基因啟動(dòng)子，并且研究了SRY蛋白與這些啟動(dòng)子的結(jié)合功能。這些實(shí)驗(yàn)必將在基因水平對(duì)奶牛進(jìn)行性別控制有深遠(yuǎn)的意義。

3、 (1)提取雄性中國(guó)荷斯坦牛的基因組DNA，根據(jù)GengBank收錄的奶牛SRY基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)使擴(kuò)增產(chǎn)物包括SRY基因編碼區(qū)的引物(因SRY基因?yàn)閱瓮怙@子基因，其編碼區(qū)可直接用以基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)獲得)，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pGEM-T載體，送至生物公司進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，已經(jīng)獲得了中國(guó)荷斯坦牛SRY基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)，基因編碼區(qū)與GeneBank收錄的奶牛SRY基因同源性達(dá)到100％。 (2)根據(jù)牛S

4、RY基因編碼區(qū)和pET-28a(+)載體設(shè)計(jì)一對(duì)分別帶有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和SalⅠ的引物，以構(gòu)建好的pGEM-T/SRY載體為模板繼續(xù)擴(kuò)增SRY基因編碼區(qū)，使SRY基因編碼區(qū)兩端帶上酶切位點(diǎn)；將獲得的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，并用T4DNA連接酶連接兩種酶切產(chǎn)物，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a/SRY；將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，送至生物公司進(jìn)行序列分析，分析結(jié)果表明成功構(gòu)

5、建了pET-28a/SRY表達(dá)載體。用IPTG對(duì)含有pET-28a/SRY表達(dá)載體的E.coliBL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)，使其表達(dá)目的蛋白SRY，對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在33ku處出現(xiàn)一條濃度較大的條帶，表明目的蛋白獲得表達(dá)。用His-單抗對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，結(jié)果顯示為陽(yáng)性，而對(duì)照組為陰性，進(jìn)一步證明了目的蛋白SRY得到了表達(dá)。 (3)利用帶有His標(biāo)簽的融合蛋白可以與Ni結(jié)合的原

6、理，用Ni-NTA蛋白純化柱對(duì)牛SRY蛋白進(jìn)行純化，得到了純度較高的SRY目的蛋白。分別以牛、人、鼠的血樣為材料，進(jìn)取基因組DNA；根據(jù)文獻(xiàn)中的牛、人、鼠的MIS基因啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)三對(duì)使擴(kuò)增產(chǎn)物包含MIS基因啟動(dòng)子的引物，并對(duì)三種啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接于pGEM-T載體，送至生物公司進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明獲得了三個(gè)物種的MIS基因啟動(dòng)子；對(duì)獲得的啟動(dòng)子用P32進(jìn)行放射性標(biāo)記。將標(biāo)記的三種啟動(dòng)子分別與純化的SRY蛋白溫浴混

7、合后進(jìn)行電泳，曝光顯影，結(jié)果顯示牛和人的MIS啟動(dòng)子被阻滯，而鼠的MIS啟動(dòng)子沒(méi)有受到影響。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)確定了，原核表達(dá)的牛SRY蛋白可以與牛和人的MIS基因啟動(dòng)子結(jié)合，而與鼠的MIS基因啟動(dòng)子沒(méi)有結(jié)合功能。這表明牛SRY蛋白對(duì)牛MIS基因的表達(dá)有調(diào)控作用，奶牛SRY作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)對(duì)其下游基因的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)奶牛的性別控制。牛SRY蛋白對(duì)人的MIS基因啟動(dòng)子的結(jié)合表明牛與人在性別調(diào)控上具有相似的作用機(jī)制，而與鼠在性別調(diào)控方面