1,25-二羥維生素D3通過β-catenin-TCF4-GSK-3β-mTOR通路介導(dǎo)自噬干預(yù)糖尿病心肌病研究.pdf

1、背景：糖尿病心肌病可增加糖尿病患者心力衰竭甚至死亡的發(fā)生風(fēng)險。盡管有大量關(guān)于糖尿病心肌病的研究，目前尚無特定有效的治療方法，且現(xiàn)存的改善血糖及心功能的藥物并未顯著降低糖尿病心肌病的發(fā)病率。近年來，大量研究表明糖尿病患者存在維生素D缺乏，而維生素D缺乏與糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)。維生素D除與免疫反應(yīng)、感染、腫瘤及代謝性疾病相關(guān)外，研究顯示維生素D還參與自噬調(diào)節(jié)。自噬對心臟形態(tài)及功能的維持具有重要作用，在1型及2型糖尿病中皆存在自

2、噬調(diào)節(jié)異常。經(jīng)典Wnt/β-catenin通路與心臟重塑、心肌肥厚及間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)該通路可能也參與糖尿病心肌病的發(fā)病過程。且β-catenin能通過其C端與VDR的第二激動功能區(qū)（AF-2）發(fā)生相互作用，β-catenin表達(dá)升高可促進(jìn)1,25D3轉(zhuǎn)錄活性。此外，研究顯示β-catenin通路的活化還可通過抑制GSK-3β來激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達(dá)。mTOR不僅參與成人心功能的調(diào)控，還是自噬通路調(diào)節(jié)的關(guān)

3、鍵組分。
　　目的：
　?。?）在大鼠H9C2細(xì)胞中探討高濃度葡萄糖對心肌細(xì)胞肥大及自噬的影響；觀察1,25D3干預(yù)對高糖介導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬及心肌細(xì)胞肥大的作用。
　?。?）構(gòu)建1型糖尿病大鼠模型及慢病毒轉(zhuǎn)染沉默VDR基因表達(dá)（Lenti-shVDR）大鼠模型，觀察各組大鼠心肌自噬水平及心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化；探討1,25D3或聯(lián)合Lenti-shVDR或氯喹（CQ）處理對糖尿病大鼠心肌自噬及其心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響。

4、r>　?。?）在高糖培養(yǎng)的 H9C2細(xì)胞和糖尿病大鼠模型中探討β-catenin/TCF4/GSK-3β/mTOR通路是否參與糖尿病心肌病發(fā)病過程，以及1,25D3保護(hù)糖尿病心肌的可能機(jī)制。
　　方法：
　　（1）培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，觀察不同濃度葡萄糖（5.5、15、25、35mmol/L）及不同濃度1,25D3（25、50、100、200、400nM）處理對心肌細(xì)胞自噬及心肌細(xì)胞活力的影響，篩選最佳干預(yù)濃度；聯(lián)合自噬抑制劑巴

5、弗洛霉素A1（bafilomycin A1）處理細(xì)胞，探討1,25D3對高糖介導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬的作用；應(yīng)用Western blot檢測心肌細(xì)胞中VDR、LC3-II/I、P62及Beclin1蛋白表達(dá)；應(yīng)用免疫熒光檢測VDR在細(xì)胞中的表達(dá)和分布；應(yīng)用透射電鏡觀察自噬體形成。
　?。?）應(yīng)用STZ構(gòu)建1型糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分為7組：正常對照組（NG）、糖尿病組（DM）、糖尿病+1,25D3組（DM+VD3）、糖尿病+1,25D3+

6、lenti-shVDR組（DM+VD3+shVDR）、糖尿病+lenti-shVDR組（DM+shVDR）、糖尿病+1,25D3+氯喹組（DM+VD3+CQ）及糖尿病+氯喹組（DM+CQ）。1,25D3或聯(lián)合CQ干預(yù)8周后，應(yīng)用心臟彩超及無創(chuàng)鼠尾套袖體積描計法系統(tǒng)檢測大鼠心臟功能及血壓的變化；稱取大鼠體重、心重并測量脛骨長度；檢測大鼠空腹血糖、血清胰島素、血清膽固醇、甘油三脂、肌酐、血鈣水平；ELISA法檢測大鼠血清及尿白蛋白、甲狀旁腺

7、激素（PTH）及25(OH)D水平；應(yīng)用熒光顯微鏡觀察Lenti-shVDR轉(zhuǎn)染大鼠后其心臟、肝臟及腎臟中綠色熒光蛋白表達(dá)；HE染色及天狼星紅染色觀察各組大鼠心臟組織結(jié)構(gòu)的病理改變；透射電鏡觀察大鼠心臟超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組化檢測大鼠心肌組織中LC3B及P62蛋白表達(dá)；Western blot檢測大鼠心肌組織中VDR、LC3-II/I、P62、Beclin1、β-catenin、TCF4、c-myc、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser

8、9)、mTOR及p-mTOR蛋白表達(dá)；應(yīng)用qRT-PCR檢測各組大鼠心肌組織中VDR、β-MHC、ANF、BNP、β-catenin、TCF4及c-myc mRNA表達(dá)水平。
　　（3）在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，聯(lián)合1,25D3及β-catenin通路活化劑氯化鋰（LiCl）干預(yù)細(xì)胞，并分為6組：正常對照組（NG,5.5mmol/L）、NG+LiCl組（NG+LiCl）、高糖組（HG,25mmol/L）、高糖+LiCl組（HG+

9、LiCl）、高糖+1,25D3組（HG+VD3）、高糖+1,25D3+LiCl組（HG+VD3+LiCl）。應(yīng)用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞VDR、β-MHC、ANF、BNP、β-Catenin、TCF4及c-myc mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測VDR、LC3-II/I、P62、Beclin1、β-catenin、TCF4、c-myc、GSK-3β、 p-GSK-3β(Ser9)、mTOR及p-mTOR蛋白表達(dá)；應(yīng)用免疫

10、熒光觀察β-catenin在心肌細(xì)胞中的表達(dá)及分布；應(yīng)用透射電鏡檢測自噬體形成。
　　結(jié)果：
　　（1）在H9C2細(xì)胞中，與葡萄糖濃度為5.5mM及15mM組相比，高糖組（25及35mmol/L）細(xì)胞中LC3-II/I及 Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低，而P62蛋白表達(dá)升高；1,25D3濃度依賴性地增加HG組（25mmol/L）細(xì)胞中LC3-II/I及Beclin1蛋白表達(dá)水平及心肌細(xì)胞自噬體形成，并降低P62蛋白表達(dá)。1,

11、25D3的上述作用在濃度為100、200和400nM時無明顯差異；聯(lián)合1,25D3（100nM）及巴弗洛霉素A1（Baf）干預(yù)后，與HG+VD3組相比，HG+Baf+VD3組細(xì)胞自噬體形成增加，且LC3-II/I及P62表達(dá)水平進(jìn)一步升高。
　　（2）與NG組相比，STZ處理組大鼠血糖明顯升高，而血清胰島素及大鼠體重降低。與NG及DM+VD3組相比，其他各組大鼠尿白蛋白及血清總膽固醇濃度升高，但血清白蛋白及甘油三酯濃度無明顯差異。

12、與NG組相比，DM及DM+CQ組大鼠血清25(OH)D濃度明顯降低，應(yīng)用1,25D3干預(yù)后兩組大鼠血清25(OH)D水平升高。盡管沉默大鼠心肌組中VDR表達(dá)升高了血清25(OH)D及PTH水平，但各組大鼠血鈣濃度無明顯差異。此外，各組大鼠的血壓及心率也無明顯差異。
　?。?）與NG相比，DM組大鼠心重/體重、心重/脛骨長度明顯增加。心臟彩超提示糖尿病大鼠左室收縮及舒張末期內(nèi)徑增加、容積增大，左室射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)及E/A比值減低；

13、HE染色及天狼星紅染色提示糖尿病大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂伴間質(zhì)纖維化；透射電鏡顯示心肌纖維破壞，伴線粒體腫脹、排列紊亂。應(yīng)用1,25D3干預(yù)8周后糖尿病大鼠上述心臟結(jié)構(gòu)及功能明顯改善。但應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染沉默VDR基因表達(dá)或聯(lián)合自噬抑制劑氯喹（CQ）干預(yù)后，上述1,25D3對糖尿病大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的改善作用消失。
　?。?）與NG組相比，DM組大鼠心肌組織中LC3-II/I及Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低，而P62蛋白表達(dá)升高。應(yīng)用1,

14、25D3干預(yù)后糖尿病大鼠心肌組織中LC3-II/I及Beclin1蛋白表達(dá)增加，而P62蛋白表達(dá)降低。聯(lián)合1,25D3及CQ干預(yù)后進(jìn)一步增加糖尿病大鼠心肌組織中LC3-II/I及P62蛋白表達(dá)水平，而沉默VDR基因則抵消了1,25D3對糖尿病大鼠心臟自噬的促進(jìn)作用。
　?。?）與NG組相比，DM組大鼠心肌組織中β-catenin、TCF4和c-myc mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，p-GSK-3β/GSK-3β和p-mTOR/m

15、TOR蛋白表達(dá)也增加；應(yīng)用1,25D3干預(yù)降低了β-catenin、TCF4和c-myc mRNA和蛋白表達(dá)水平，以及p-GSK-3β/GSK-3β和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平；1,25D3的上述作用在沉默糖尿病大鼠VDR基因表達(dá)后消失。
　?。?）在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，與NG組相比，HG組細(xì)胞β-catenin、TCF4和c-myc mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，p-GSK-3β/GSK-3β和p-mTOR/mTOR

16、蛋白表達(dá)增加，表明高糖誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞中β-catenin/TCF4/GSK-3β/mTOR通路表達(dá)；應(yīng)用1,25D3（100nM）處理細(xì)胞后抑制了高糖誘導(dǎo)的該通路的激活。此外，與HG+VD3組相比，聯(lián)合LiCl處理后細(xì)胞中 ANF、BNP及β-MHC mRNA表達(dá)增加，LC3-II/I和beclin1蛋白表達(dá)降低，自噬體形成減少，而P62蛋白表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論：
　?。?）在H9C2細(xì)胞中，高糖可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大并抑

17、制心肌細(xì)胞自噬，1,25D3處理后抑制了高糖介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大并恢復(fù)心肌自噬水平。
　　（2）在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠中，糖尿病大鼠心臟自噬水平降低并出現(xiàn)心肌結(jié)構(gòu)紊亂、間質(zhì)纖維化和心功能障礙；1,25D3與VDR結(jié)合后可通過恢復(fù)心臟自噬部分改善糖尿病誘導(dǎo)的心臟結(jié)構(gòu)紊亂和功能障礙。
　　（3）在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞和STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠心臟中，β-catenin/TCF4/GSK-3β/mTOR通路表達(dá)增高，1,2

18、5D3與VDR結(jié)合后可抑制β-catenin/TCF4/GSK-3β/mTOR通路的表達(dá)；而聯(lián)合1,25D3及LiCl干預(yù)則抵消1,25D3對高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用，并引起心肌細(xì)胞肥大。
　　綜上，本課題研究結(jié)果顯示1,25D3可顯著改善糖尿病大鼠心功能障礙、心肌結(jié)構(gòu)紊亂及間質(zhì)纖維化。1,25D3可能是通過與VDR結(jié)合來抑制心肌組織中β-catenin/TCF4/GSK-3β/mTOR通路的表達(dá)，從而恢復(fù)心肌自噬水平