1,25-二羥維生素D3通過VDR-PPARγ通路促使高糖誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)換.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(DN)的發(fā)生發(fā)展不僅與腎組織浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，更與其所呈現(xiàn)的活化狀態(tài)密切相關(guān)。目前認(rèn)為，經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1)具有促炎促纖維化作用，而替代活化巨噬細(xì)胞(M2)則發(fā)揮抗炎活性。近期研究發(fā)現(xiàn)，核受體PPARγ參與巨噬細(xì)胞表型活化過程，而活性維生素D(1，25(OH)2D3)具有鈣磷代謝調(diào)節(jié)以外的腎保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制目前尚未完全闡明。本研究擬通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)探討1,25(OH)2D3對高糖環(huán)境下巨

2、噬細(xì)胞活化狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:
　　采用葡萄糖濃度(11.1mM，20mM，25mM，30mM)和時(shí)間(0h，6h，12h，24h，36h，48h)依賴性刺激小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)，酶活性法檢測細(xì)胞內(nèi)iNOS活力。10-8mol/L1，25(OH)2D3刺激高糖預(yù)孵育的RAW264.7細(xì)胞，RT-PCR和Western blot分別檢測M1標(biāo)志物iNOS以及M2型細(xì)胞標(biāo)志物MR和Arg-1

3、的表達(dá);ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12和IL-10的水平。然后用VDR siRNA和PPARγ拮抗劑分別沉默和阻斷相應(yīng)受體后，再次用上述方法檢測M1和M2各標(biāo)志物的水平，并進(jìn)一步用免疫熒光觀察他們的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)細(xì)胞內(nèi)iNOS活力呈葡萄糖濃度和時(shí)間依賴性表達(dá)增加，并且在25mmol/L葡萄糖刺激細(xì)胞24h后iNOS活力達(dá)到最大。與對照組相比，25mmol/L葡萄糖干預(yù)RAW264.7細(xì)胞

4、24h后，不僅上清液中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-12表達(dá)增多，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示M1標(biāo)志物iNOS也表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而M2標(biāo)志物MR和Arg-1的表達(dá)則顯著下降(P＜0.05)。(2)1，25(OH)2D3干預(yù)后，上述趨勢被逆轉(zhuǎn):M1標(biāo)志物包括TNF-α、IL-12和iNOS的表達(dá)明顯減少，而M2標(biāo)志物IL-10、Arg-1和MR則表達(dá)增加，并且核受體VDR和PPARγ表達(dá)也顯著增多(P＜0.0

5、5)。(3)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VDR siRNA和PPARγ拮抗劑阻斷相應(yīng)受體后，活性維生素D的上述作用均被阻斷，而沉默VDR后PPARγ表達(dá)也相應(yīng)減少（與VD組比較1.16±0.08 vs0.48±0.05;P＜0.05)。同樣免疫熒光顯示與VD組相比，抑制VDR和PPARγ表達(dá)后，iNOS熒光明顯增強(qiáng)，MR和PPARγ熒光表達(dá)則明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　1.高糖能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型活化;
　　2.1，25-二羥維生