Nox4型NADPH氧化酶在狼瘡性腎炎腎臟纖維化中的作用及其干預(yù)研究.pdf

1、背景：
　　狼瘡性腎炎(Lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupuserythematosus，SLE)最常見的并發(fā)癥，最終進(jìn)展為終末期腎臟病(End-stage renaldisease，ESRD)，而腎臟纖維化則是各種慢性腎臟病(Chronic kindey disease，CKD)的共同最終通路。在腎臟纖維化的過(guò)程中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal tr

2、ansition，EMT)是腎臟產(chǎn)生大量纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞及基質(zhì)沉積的重要途徑。LN過(guò)程中大量自身抗體及免疫復(fù)合物的形成可造成腎臟的氧化應(yīng)激損傷，產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，可誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)發(fā)生EMT進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化。NADPH氧化酶(Nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH Oxidase)系統(tǒng)是ROS的主要來(lái)源，其中Nox4

3、是腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的主要類型，但Nox4來(lái)源的ROS是否參與腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT尚未可知。研究發(fā)現(xiàn)，在肺泡上皮細(xì)胞中，E3泛素連接酶Cb1-c可啟動(dòng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-proteasome system，UPS）促進(jìn)Nox4的降解延緩肺的纖維化，但目前Cb1-c在腎臟是否能發(fā)揮類似作用尚無(wú)相關(guān)研究。本研究旨在探討Nox4型NADPH氧化酶在狼瘡性腎炎腎臟纖維化中的作用以及泛素化降解Nox4的干預(yù)作用。
　

4、　目的：
　　探討Nox4型NADPH氧化酶在狼瘡性腎炎(LN)腎小管上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及其干預(yù)研究，為狼瘡性腎炎腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制研究和臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.收集2014年1月-2015年8月河南省人民醫(yī)院腎內(nèi)科收治并行腎活檢病理檢查確診為L(zhǎng)N的患者31例，取其腎穿刺組織作為實(shí)驗(yàn)組，另取3例腎臟腫瘤患者的瘤旁組織作為正常對(duì)照組，應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)所有腎臟組織標(biāo)本中腎小管間質(zhì)內(nèi)Nox

5、4型NADPH氧化酶(Nox4)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)的表達(dá)情況并進(jìn)行半定量分析。
　　2.以抗ds-DNA抗體刺激人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)模擬狼瘡性腎炎(LN)的過(guò)程，將常規(guī)培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞分為以下4組:(1)正常對(duì)照組(10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基)，(2)抗體組（10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基+100ug/ml抗ds-DNA抗體），(3)空轉(zhuǎn)組（10％FBS的DMEM-F

6、12培養(yǎng)基+Cb1-c cDNA轉(zhuǎn)染），(4)轉(zhuǎn)染+抗體組（10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基+Cb1-c cDNA轉(zhuǎn)染+100ug/ml抗ds-DNA抗體）。給藥72h后，對(duì)以上各組細(xì)胞進(jìn)行以下檢測(cè):①采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況;②酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)水平;③采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞的活性氧(ROS)水平;④采用Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞的Nox4蛋白、鈣

7、粘附蛋白(E-cadherin)、α-SMA蛋白、FN蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.腎臟組織免疫熒光結(jié)果顯示，LN患者腎臟組織的小管上皮處有微弱表達(dá)的Nox4，在腎小球系膜區(qū)和腎小管間質(zhì)內(nèi)可見大量α-SMA、FN的表達(dá)，且其表達(dá)量與LN的病理類型相關(guān)，病理類型為Ⅱ型的表達(dá)量相對(duì)較少，Ⅳ型相對(duì)較多;而正常對(duì)照組中，均無(wú)相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)。
　　2.1.抗ds-DNA抗體培養(yǎng)一定時(shí)間后，HK-2細(xì)胞的增殖活力降低，

8、鏡下察到細(xì)胞形態(tài)由多邊形變化為梭形，細(xì)胞間隙增大;而轉(zhuǎn)染+抗體組中HK-2細(xì)胞的增殖活力較抗體組有所增加?？筪s-DNA抗體還能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量TGF-β1，而轉(zhuǎn)染+抗體組中的TGF-β1較抗體組無(wú)明顯改變，提示狼瘡性腎炎中可產(chǎn)生大量促纖維化因子TGF-β1，而過(guò)表達(dá)Cb1-c對(duì)TGF-β1的分泌無(wú)特殊作用。
　　2.2.抗ds-DNA抗體培養(yǎng)一定時(shí)間后，HK-2細(xì)胞的Nox4蛋白水平較對(duì)照組明顯上調(diào)，ROS水平顯著增高

9、，提示狼瘡性腎炎中Nox4型NADPH氧化酶的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)ROS的生成。Cb1-c轉(zhuǎn)染可顯著降低Nox4的表達(dá);與抗體組相比，轉(zhuǎn)染+抗體組中HK-2細(xì)胞的Nox4蛋白水平和ROS的生成均明顯降低，提示促進(jìn)Nox4型NADPH氧化酶的降解可有效減少ROS的產(chǎn)生。
　　2.3.與對(duì)照組相比，抗體組中腎小管上皮細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA蛋白、FN蛋白水平顯著增高，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-Cadherin蛋白水平明顯降低;而與抗體組相比，

10、轉(zhuǎn)染+抗體組中的α-SMA蛋白、FN蛋白水平明顯降低，E-Cadherin蛋白水平有所增高。這提示狼瘡性腎炎中的腎小管上皮細(xì)胞可發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)，且與Nox4型NADPH氧化酶的活化密切相關(guān)，而促進(jìn)Nox4的降解可顯著抑制EMT的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1.狼瘡性腎炎中Nox4型NADPH氧化酶/ROS氧化應(yīng)激通路的激活，可促使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生。
　　2.泛素化降解