NADPH氧化酶4在糖尿病視網(wǎng)膜病變中作用及機制的研究.pdf

1、目的：
　　 糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病常見的眼部并發(fā)癥和致盲的主要原因之一。炎癥反應和氧化應激是DR時內(nèi)皮功能障礙、血管滲漏和新生血管形成的重要原因。我們首先探討了洛伐他汀(Lovastatin)對DR保護作用的抗炎及抗氧化機制；同時闡明NADPH氧化酶4(Nox4)在糖尿病視網(wǎng)膜表達情況及其在DR血管滲漏和新生血管形成中的作用，并進一步探討NADPH氧化酶4作為視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(RECs)內(nèi)活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生

2、的主要來源對血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)表達及VEGF介導信號通路的影響。
　　 方法：
　　 (1)Lovastatin干預作用及機制研究：采用db/db小鼠作為DR動物模型，19周齡db/db小鼠按10 mg/(kg·d)劑量給予Lovastatin灌胃處理6周。采用Westernblot檢測Lovastatin干預對糖尿病視網(wǎng)膜血管白蛋白滲漏、緊密連接蛋白Occludin、前炎癥因子如細胞間粘附分子1(ICAM

3、-1)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達以及Nox4和VEGF產(chǎn)生的影響。采用缺氧(2％ O2)處理RECs，觀察Lovastatin對缺氧誘導的RECs中ICAM-1和TNF-α表達的作用。將RECs和/或人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE-19)暴露于TNF-α，Western blot檢測Lovastatin處理對ICAM-1及Occludin表達的作用，ICC或DNA結(jié)合活性分析檢測Lovastatin預處理對TNF-α誘導的核因子

4、-κB3活化的影響。ROS敏感熒光探針CM-H2DCFDA檢測Lovastatin預處理對缺氧誘導的RECs中ROS產(chǎn)生的影響。給予下述氧化酶抑制劑預處理RECs：NADPH氧化酶抑制劑(DPI)、一氧化氮合成酶抑制劑(L-NAME)、黃嘌呤氧化酶抑制劑(Allopurinol)和線粒體電子傳遞鏈抑制劑(Rotenone)，觀察其對缺氧誘導ROS產(chǎn)生的抑制作用。實時定量RT-PCR檢測RECs中NADPH氧化酶異構(gòu)體表達的主要形式。We

5、stern blot和/或ICC檢測Lovastatin對缺氧誘導RECs中Nox4表達定位以及VEGF產(chǎn)生的影響。
　　 (2)Nox4在DR血管滲漏中作用及機制的研究：通過玻璃體腔內(nèi)注射Nox4siRNA腺病毒(Ad-Nox4i)敲除db/db小鼠視網(wǎng)膜Nox4表達，伊文思蘭血管通透性分析檢測db/db小鼠視網(wǎng)膜血管的滲漏情況，新鮮全眼球冰凍切片ROS敏感熒光探針CM-H2DCFDA檢測db/db小鼠視網(wǎng)膜NADPH氧化酶的

6、活性，Western blot檢測db/db小鼠視網(wǎng)膜Nox4及VEGF表達水平。顯性負突變Nox4腺病毒(Ad-Nox4△FAD)感染RECs抑制Nox4活性，用缺氧(2％O2)或高糖(25mM)處理感染后的RECs，Western blot檢測VEGF和HIF1-α或p-STAT3的表達，ROS敏感熒光探針CM-H2DCFDA、DHE和amplex red檢測缺氧或高糖誘導的細胞內(nèi)、外ROS的產(chǎn)生。野生型Nox4腺病毒(Ad-Nox

7、4WT)感染RECs，CM-H2DCFDA和amplex red分別觀察細胞內(nèi)、外ROS的產(chǎn)生，Western blot檢測過表達Nox4對RECs中HIF1-α和VEGF產(chǎn)生的影響。
　　 (3)Nox4在視網(wǎng)膜新生血管形成中作用及機制研究：建立高氧誘導的新生鼠視網(wǎng)膜病變模型(OIR)模擬糖尿病性視網(wǎng)膜新生血管。Western blot和/或ELISA檢測視網(wǎng)膜血管閉塞階段(p12)和新生血管形成階段(p15或p17)視網(wǎng)膜N

8、ox4和VEGF表達水平。IHC檢測視網(wǎng)膜新生血管形成高峰(p17)時Nox4在OIR小鼠視網(wǎng)膜的表達定位。通過球周注射Ad-Nox4i載體敲除OIR小鼠視網(wǎng)膜Nox4的表達，異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐(FITC-Dextran)血管造影和視網(wǎng)膜鋪片定量OIR小鼠無血管區(qū)形成，全眼球石蠟切片蘇木素-伊紅(HE)染色計數(shù)OIR小鼠視網(wǎng)膜前新生血管核的數(shù)目評價OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的程度，Western blot檢測OIR小鼠視網(wǎng)膜

9、Nox4和VEGF表達水平。Ad-Nox4i感染RECs從基因水平敲除Nox4表達，將RECs暴露于缺氧(2％ O2)，Western blot檢測HIF1-α和VEGF的表達，DHE檢測細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生?；|(zhì)膠(Matrigel)體外檢測RECs的管腔形成能力，跨膜遷移試驗(Transwell assay)評價RECs的移行功能。此外，通過Western blot檢測Nox4對VEGF介導的促分裂原活化激酶(MAPK)信號通路中ER

10、K1/2和p38活化的作用。
　　 結(jié)果：
　　 (1)與同窩對照小鼠相比db/db小鼠視網(wǎng)膜Nox4表達上調(diào)并與ICAM-1、TNF-α和VEGF水平升高以及視網(wǎng)膜屏障破壞和血管滲漏相一致(p＜0.05或p＜0.01)。Lovastatin處理后明顯減輕db/db小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏和抑制Occludin表達下調(diào)并降低ICAM-1、TNF-α、VEGF和Nox4表達(p＜0.05或p＜0.01)。體外研究發(fā)現(xiàn)Lovast

11、atin處理明顯抑制缺氧誘導的RECs中前炎癥因子ICAM-1和TNF-α表達(p＜0.05)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Lovastatin處理抑制TNF-α誘導的ARPE-19中核因子-κB活化(p＜0.05)以及降低TNF-α誘導的RECs和APRE-19中ICAM-1的表達(p＜0.05)。體外培養(yǎng)的RECs中，Nox4的mRNA水平高出其他NADPH氧化酶異構(gòu)體數(shù)百倍，其蛋白表達在RECs中呈核周分布并受缺氧調(diào)節(jié)，Lovastatin處

12、理后明顯抑制缺氧誘導Nox4和VEGF的表達并降低缺氧介導的細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生(p＜0.05或p＜0.01)。
　　 (2)玻璃體腔注射Ad-Nox4i從基因水平敲除Nox4的表達可以明顯抑制db/db小鼠視網(wǎng)膜VEGF的表達(p＜0.01)、減少ROS的產(chǎn)生(p＜0.05)并緩解了視網(wǎng)膜血管滲漏(p＜0.05)。感染Ad-Nox4△FAD抑制Nox4活性分別通過HIF1-α和p-STAT3依賴的機制抑制缺氧或高糖誘導的RECs中

13、ROS產(chǎn)生和VEGF表達(p＜0.01或p＜0.05)。感染Ad-Nox4WT過表達Nox4顯著升高RECs中ROS的產(chǎn)生(p＜0.01)并上調(diào)HIF1-α和VEGF的水平(p＜0.05)。
　　 (3)OIR小鼠高氧誘導的視網(wǎng)膜血管閉塞階段Nox4表達下調(diào)(p＜0.05)而視網(wǎng)膜新生血管形成階段Nox4表達明顯升高(p＜0.01)，與VEGF表達變化趨勢相一致。免疫組織化學顯示OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成高峰Nox4主要表達于

14、視網(wǎng)膜內(nèi)界膜玻璃體面的新生血管處，此外視網(wǎng)膜內(nèi)核層及外叢狀層處視網(wǎng)膜固有血管Nox4表達也上調(diào)。應用Ad-Nox4i從基因水平敲除視網(wǎng)膜Nox4的表達可以明顯抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜無灌注區(qū)(p＜0.05)及新生血管的形成(p＜0.01)并降低視網(wǎng)膜VEGF的表達(p＜0.05)。感染Ad-Nox4i后明顯抑制缺氧誘導的RECs中ROS產(chǎn)生(p＜0.01)以及HIF1-α和VEGF表達。此外，感染Ad-Nox4i敲除RECs中Nox4表達可

15、以明顯降低VEGF誘導的RECs管腔形成(p＜0.01)和移行能力(p＜0.01)以及抑制VEGF誘導的ERK1/2和p38 MAPK磷酸化(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 Lovastatin主要通過降低視網(wǎng)膜前炎癥因子產(chǎn)生及抑制氧化應激反應發(fā)揮對糖尿病血-視網(wǎng)膜屏障功能的保護作用。Nox4作為RECs中ROS產(chǎn)生的重要來源，其在糖尿病視網(wǎng)膜中表達的上調(diào)介導了糖尿病視網(wǎng)膜血管滲漏和病理性視網(wǎng)膜新生血管的形成。從基