血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)在斷奶仔豬體內(nèi)的表達(dá)分布及在胃酸分泌中的作用.pdf

1、本研究旨在研究血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)在斷奶仔豬中體內(nèi)的表達(dá)分布及在胃酸分泌中的作用與機(jī)理。研究包括以下三個方面的主要內(nèi)容:
　　1、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2的基因克隆及在仔豬體內(nèi)的表達(dá)分布
　　本研究通過克隆仔豬ACE2基因，確定ACE2基因在健康斷奶仔豬體內(nèi)的表達(dá)分布及在胃腸道中的細(xì)胞學(xué)定位，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定理論基礎(chǔ)。實驗采取6頭35日齡健康斷奶仔豬心、肝、脾、肺、腎、胃腸道及腦等組織樣品，進(jìn)行如下試驗1）克

2、隆ACE2基因、擴(kuò)增并鑒定仔豬ACE2基因序列片段，進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化分析;2）RT-PCR法確定ACE2基因在斷奶仔豬體內(nèi)各組織器官中的表達(dá)分布;3）免疫組化法確定ACE2蛋白在組織中的細(xì)胞定位。結(jié)果1）本實驗成功克隆出了仔豬ACE2基因部分序列，該核苷酸序列與GenBank上公布的野豬ACE2核苷酸序列同源性達(dá)到98％。與歐洲牛的同源性為87.8％，與人的同源性為78.8‰與禽類（雞）的同源性較低。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該擴(kuò)增片段與牛的

3、遺傳距離最近，與雞則處在完全不同的2個分枝上。氨基酸進(jìn)化與基因遺傳進(jìn)化結(jié)果一致。2）RT-PCR結(jié)果顯示:ACE2基因在仔豬體內(nèi)廣泛分布，尤其在腎臟、胃底、回腸、十二指腸、空腸中都有較高水平的表達(dá);3）胃腸道免疫組化結(jié)果顯示:ACE2蛋白在仔豬胃腸道中都有分布，在胃底部、小腸各部位的腸上皮細(xì)胞刷狀緣有顯著表達(dá)。
　　2、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2在不同日齡仔豬胃腸道中表達(dá)差異比較
　　上一章的研究中發(fā)現(xiàn)，ACE2在仔豬各組織器官均有

4、表達(dá)，以腎臟和胃腸道表達(dá)量較高。本章進(jìn)一步比較研究了ACE2在不同日齡仔豬胃腸道中的表達(dá)差異。本章實驗選取剛出生健康蘇姜仔豬，試豬21日齡一次性斷奶后隨機(jī)分為試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組;試驗Ⅰ組:在21日齡宰殺;試驗Ⅱ組:斷奶后正常飼養(yǎng)兩星期后于35日齡宰殺;于宰殺當(dāng)日，頸部放血處死，取胃體、胃底、空腸、回腸、十二指腸、結(jié)腸等組織樣品，進(jìn)行如下試驗:1）Real-time PCR定量分析兩組斷奶仔豬胃體、胃底、空腸、回腸、十二指腸、結(jié)腸中ACE

5、2基因的表達(dá)差異;2）Western blot分析ACE2蛋白在胃底和空腸中的表達(dá)差異;3）測定胃底和空腸組織中RNA/DNA的值，分析該比率與仔豬日齡的關(guān)系;4）相關(guān)性分析ACE2蛋白與仔豬胃腸道中RNA/DNA的關(guān)系，以分析ACE2蛋白與仔豬發(fā)育的變化趨勢;結(jié)果1）Real-time PCR結(jié)果顯示:ACE2mRNA在仔豬胃底、胃體、空腸、回腸、十二指腸和結(jié)腸組織中均有表達(dá);在胃底組織，隨著仔豬日齡的增加，ACE2基因表達(dá)量顯著增多

6、（P＜0.05）;但胃體組織中無差異(P＞0.05）。在腸道組織中隨著仔豬日齡的增長，ACE2基因在斷奶仔豬各腸道中的表達(dá)量均呈增長趨勢，表達(dá)量從高到低依次為空腸，回腸，十二直腸和結(jié)腸。其中空腸中ACE2基因表達(dá)量較21日齡顯著增加(P＜0.05);2)Western blot結(jié)果表明:ACE2蛋白在斷奶仔豬的胃底和空腸中均有表達(dá)，隨著仔豬日齡的增加，均顯著性升高（P＜0.05）;3）RNA/DNA的比值隨著仔豬日齡的增加，胃底和空腸組

7、中比值也增加（1.47±0.21 VS1.61±0.18;2.17±0.26 VS3.02±0.15）;4）相關(guān)性分析結(jié)果表明:ACE2蛋白與胃底和空腸組織中的RNA/DNA值呈正相關(guān)(P＜0.05)，即隨著仔豬日齡的增加，RNA/DNA的比值升高，ACE2蛋白含量也升高。提示:ACE2在仔豬胃腸發(fā)育的生理和病理過程中可能具有重要作用。
　　3、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2對不同日齡仔豬胃酸分泌的影響及其機(jī)制初探
　　前兩章的研究中發(fā)

8、現(xiàn)，ACE2在不同日齡仔豬胃腸道中有表達(dá)，隨著日齡的增加以胃底和空腸組織中表達(dá)顯著升高，本章對ACE2在仔豬胃中，特別是胃酸分泌中的可能作用及機(jī)制進(jìn)行了探討。試驗設(shè)計同第二部分，每期試驗結(jié)束取血液和胃底組織樣品，進(jìn)行如下試驗:1）對兩組所有仔豬的胃食糜pH、血清中胃泌素含量以及胃底組織中H+-K+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶、胃蛋白酶等酶活性進(jìn)行測定;2）定量分析兩組動物胃底組織中ACE2 mRNA以及蛋白表達(dá)水平;3）定量分析胃

9、底局部組織中RAS中ACE、ACE2、AT1、AT2和Mas的mRNA水平，同時測定其中AngⅡ含量。結(jié)果:1)隨著仔豬日齡的增加，胃食糜pH由4.42±0.07降至3.65±0.06，胃內(nèi)酸度有所緩和;血清中胃泌素含量極顯著升高(P＜0.01)，胃底組織中H+-K+ATP酶活力顯著升高(P＜0.05)，胃蛋白酶、Na+-K+-ATP酶兩組之間無明顯差異(P＞0.05);2)ACE2 mRNA以及ACE2蛋白在斷奶仔豬的胃底組織中均有表

10、達(dá)，并且隨著日齡的增加，表達(dá)量均顯著增高(P＜0.05）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ACE2與胃泌素含量和H+-K+-ATP酶活性呈正相關(guān)，其中與后者高度正相關(guān)(P＜0.05);3)仔豬胃底組織中存在局部RAS所有成分的基因表達(dá)，隨著仔豬日齡的增加，ACE、AT1、AT2 mRNA的表達(dá)無差異性變化(P＞0.05)，AngⅡ的含量略有降低;ACE2受體Mas的mRNA表達(dá)上調(diào);ACE/ACE2及AT1/Mas比值均明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論: