自噬與MALAT1在ox-LDL介導(dǎo)血管細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　目前，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，有統(tǒng)計(jì)顯示農(nóng)村為44.6％，城市為42.51％。心血管病的疾病負(fù)擔(dān)日漸加重，已成為重大的公共衛(wèi)生問題。在心血管病中動脈粥樣硬化(Athero slerosis，AS)嚴(yán)重危害人類健康。在AS形成過程中血管內(nèi)膜的損傷是其始動環(huán)節(jié)，內(nèi)皮通透性、黏附性和血液凝固性的改變及所釋放的大量細(xì)胞因子導(dǎo)致血管壁發(fā)生一系列連鎖反應(yīng)，從而導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)的改變。具體表現(xiàn)為內(nèi)膜的脂質(zhì)浸潤、血管平滑

2、肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)和巨噬細(xì)胞遷移和泡沫細(xì)胞的形成其中，VSMC是增殖體系中最活躍的細(xì)胞。即內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和VSMC的異常增殖是AS發(fā)生發(fā)展過程中兩個重要環(huán)節(jié)，所以針對內(nèi)皮損傷的修復(fù)及VSMCs異常增殖的防治能促進(jìn)血管損傷的修復(fù)，對于AS的預(yù)防和治療至關(guān)重要。而內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞損傷后修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞。所以我們的

3、研究是基于在AS危險因素——氧化低密度脂蛋白(oxide lowdensity lipoprotein，ox-LDL)環(huán)境下，分兩部分對EPCs和VSMCs增殖能力的變化和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索。
　　第一部分 自噬在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的EPCs增殖中的作用
　　EPCs在1997年被首次發(fā)現(xiàn)并且命名。之后的研究發(fā)現(xiàn)，EPCs有改善內(nèi)皮功能，增加血管新生的作用，并且揭示了高脂血癥、高血壓等AS相關(guān)高危因素與EPCs數(shù)量的減少密切

4、相關(guān)，EPCs數(shù)量的減少還可以作為AS進(jìn)展的獨(dú)立危險因素。在動物模型中，如兔的腦缺血模型、大鼠急性腎損傷模型等，基于EPCs移植相關(guān)的研究也發(fā)現(xiàn)EPCs可以改善缺血造成的損傷。但是移植研究距離臨床應(yīng)用還有較大距離。所以在應(yīng)激環(huán)境下，提高EPCs的生存至關(guān)重要。
　　自噬是機(jī)體在應(yīng)激環(huán)境下產(chǎn)生的一種以高效節(jié)約體內(nèi)物質(zhì)為基礎(chǔ)的自我保護(hù)行為。研究發(fā)現(xiàn)自噬可以降低凋亡并且維持細(xì)胞活性。2011年，科學(xué)雜志的一項(xiàng)研究進(jìn)一步從機(jī)制層面揭示了自

5、噬的抗凋亡作用可以通過上調(diào)抗凋亡蛋白和清除促凋亡蛋白實(shí)現(xiàn)。目前，自噬在心血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞、VSMC、心肌細(xì)胞等中都有研究，但是自噬對于EPCs的相關(guān)研究還比較少見。所以我們的研究旨在通過ox-LDL刺激EPCs，從而觀察自噬對EPCs增殖能力的影響。
　　第二部分 長鏈非編碼RNA MALAT1在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的VSMCs增殖中的作用及機(jī)制
　　AS是引起心腦血管疾病的重要因素，這與VSMCs的增殖密切相關(guān)。在AS發(fā)

6、生發(fā)展中，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作為觸發(fā)點(diǎn)，之后引起一系列改變，導(dǎo)致炎癥因子分泌等，最終，造成管腔狹窄的主要細(xì)胞成分是異常增殖的VSMC。此外，動脈壁中膜VSMC的增殖或肥大是高血壓血管壁增厚的主要原因。所以，針對針對VSMCs異常增殖的研究對于AS及高血壓等疾病的防治至關(guān)重要。
　　長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA) MALAT-1又名核富集常染色體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2(Nuclera-enriched aut

7、osomaltranscript2，NEAT2)屬長鏈非編碼RNA家族的重要成員，最早于2003年在非小細(xì)胞肺癌研究中被發(fā)現(xiàn)。MALAT1在多種組織中表達(dá)。近幾年的研究也發(fā)現(xiàn)，在高糖、缺氧環(huán)境下MALAT1可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。然而MALAT1對于與心血管疾病密切相關(guān)的VSMCs的作用目前尚未見報道。因此我們旨在通過ox-LDL刺激VSMCs來研究MALAT1對VSMCs增殖的影響，并探索可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　

8、　第一部分
　　1.1 我們首先進(jìn)行了EPCs的培養(yǎng)、鑒定。分離并研碎大鼠脾臟后，用密度梯度離心后將獲得的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后在鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙染法進(jìn)行鑒定。
　　1.2 采用同樣的方法獲得EPCs，并將EPCs接種至E-plate8細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用不同濃度（0μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、100μg/ml）的ox-LDL處理EPCs，繼

9、續(xù)培養(yǎng)，使用實(shí)時細(xì)胞分析技術(shù)(real time cellular analysis，RTCA)檢測各組細(xì)胞的增殖活性。
　　1.3 使用同上濃度的ox-LDL處理EPCs后，并在不同時間點(diǎn)(0h、6h、12h、18h、24h)提取各組EPCs總蛋白，使用western blot技術(shù)進(jìn)行分析能夠反映自噬水平的p62蛋白的相對表達(dá)水平。
　　第二部分
　　2.1 我們首先培養(yǎng)了人冠狀動脈VSMC，不同濃度（0μg/ml、

10、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）ox-LDL處理細(xì)胞，使用CCK8檢測VSMC增殖能力的變化。
　　2.2 并且在不同濃度ox-LDL處理細(xì)胞后提取總RNA，使用實(shí)時熒光定量PCR檢測不同組間的MALAT1的表達(dá)變化。
　　2.3 合成人源性小干擾RNA(si-malat1)，并轉(zhuǎn)染VSMCs細(xì)胞，抑制MALAT1的表達(dá)。使用實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　2.4

11、使用CCK8檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的變化，并且比較si-malalt1組和si-malalt1+ox-LDL組增殖能力的變化。
　　2.5 使用western blot技術(shù)檢測增殖相關(guān)蛋白p-AKT/AKT在ox-LDL處理、si-malalt1處理及si-malalt1干擾后加ox-LDL處理后各組的表達(dá)。
　　2.6 在si-malat1處理細(xì)胞后，給予AKT激動劑(SC-79)用CCK8法觀察VSMC增殖能力的變化。<

12、br>　　2.7 使用小干擾RNA(si-stim1)處理細(xì)胞后，用western blot技術(shù)檢測p-AKT/AKT的表達(dá)，用CCK8檢測其對細(xì)胞增殖的影響。
　　2.8 使用si-malat1處理細(xì)胞，提取蛋白，檢測STIM1的表達(dá)。在共聚焦顯微鏡下結(jié)合TG及CaCl2檢測鈣內(nèi)流情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.1 成功分離培養(yǎng)EPCs，培養(yǎng)的細(xì)胞延伸似梭形，呈典型的EPCs形態(tài)。雙染法陽性細(xì)胞可達(dá)8

13、5％。
　　1.2 ox-LDL呈濃度依賴性地抑制EPCs的增殖活性。
　　1.3 ox-LDL呈濃度和時間依賴性地抑制p62的表達(dá)。
　　1.4 shAtg7和3-MA抑制自噬，也可以在ox-LDL環(huán)境下進(jìn)一步抑制EPCs的增殖。
　　第二部分
　　2.1 ox-LDL呈濃度和時間依賴性地促進(jìn)VSMCs的增殖能力。
　　2.2 ox-LDL呈濃度依賴性地促進(jìn)MALAT1的表達(dá)。
　　2.3 敲

14、減MALAT1可逆轉(zhuǎn)ox-LDL對VSMCs的促增殖作用。
　　2.4 抑制MALAT1可降低ox-LDL誘導(dǎo)的AKT磷酸化。
　　2.5 抑制MALAT1可減少AKT激動劑對VMSCs的促增殖作用。
　　2.6 抑制MALAT1可抑制STIM1及鈣庫操縱性鈣內(nèi)流。
　　2.7 抑制STIM1也抑制AKT磷酸化及VSMCs增殖。
　　結(jié)論：
　　第一部分 自噬在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的EPCs增殖中的作

15、用
　　1.1 ox-LDL抑制EPCs增殖的同時也促進(jìn)了其自噬水平。
　　1.2 自噬可減輕ox-LDL對EPCs增殖的抑制作用。
　　第二部分 長鏈非編碼RNA MALAT1在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的VSMCs增殖中的作用及機(jī)制
　　2.1 ox-LDL可增加MALAT1的表達(dá)，同時也促進(jìn)了VSMCs的增殖。
　　2.2 MALAT1可通過調(diào)節(jié)AKT的磷酸化，參與ox-LDL對VSMC的促增殖作用。