炎癥對(duì)肝臟FAT-CD36的表達(dá)及脂質(zhì)積聚的影響.pdf

1、第一部分炎癥因子對(duì)HepG2細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá)及脂質(zhì)積聚的影響
　　 目的:包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、胰島素抵抗等在內(nèi)的代謝性疾病的發(fā)生與慢性炎癥有密切的關(guān)系。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acidtranslocase，F(xiàn)AT/CD36)是一種在體內(nèi)分布十分廣泛的膜糖蛋白，并且在脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著非常重要的作用。但目前對(duì)于炎癥是否能通過(guò)影響組織細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá)從而導(dǎo)致脂肪酸異常轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)尚不清楚

2、。因此，在體外實(shí)驗(yàn)的部分我們使用炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)處理脂肪酸負(fù)荷的人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，觀察炎癥對(duì)細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá)及脂質(zhì)積聚的影響以及細(xì)胞損傷的情況。
　　 方法:首先予濃度分別為0、0.04、0.08、0.16、0.32mmol/L的軟脂酸處理HepG2細(xì)胞24h，采用Western blot和RT-PCR的方法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞FAT/CD36的蛋白和基因表

3、達(dá)水平，用油紅O染色觀察各組的脂質(zhì)積聚程度。然后用炎癥因子TNF-α(25ng/ml)或IL-6（20ng/ml）單獨(dú)或聯(lián)合軟脂酸（0.04mmol/L）處理HepG2細(xì)胞24h，用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞FAT/CD36的蛋白表達(dá)水平，用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的情況，再分別用酶法和ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞的TG和FFA的含量，然后進(jìn)一步檢測(cè)各組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)水平以及過(guò)氧化氫(H2O2)和活性

4、氧(ROS)的含量。
　　 結(jié)果:(1)軟脂酸呈濃度依賴性上調(diào)HepG2細(xì)胞FAT/CD36的蛋白（r=0.873，P＜0.05）和mRNA（r=0.884，P＜0.05）的表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚程度。(2)炎癥因子TNF-α和IL-6能明顯刺激脂肪酸負(fù)荷的HepG2細(xì)胞FAT/CD36的蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加(P＜0.05)。(3)油紅O染色顯示炎癥因子能明顯促進(jìn)脂肪酸負(fù)荷的HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)積聚程度，胞內(nèi)TG和FFA定量檢

5、測(cè)的結(jié)果也均與油紅O染色的結(jié)果一致(P＜0.05)。(4)炎癥狀態(tài)下，HepG2細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)水平、H2O2和ROS的含量都是明顯升高的（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:炎癥因子可以上調(diào)HepG2細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá)、加重細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚，并引起細(xì)胞的損傷。
　　 第二部分炎癥對(duì)小鼠肝臟組織FAT/CD36的表達(dá)及脂質(zhì)積聚的影響
　　 目的:低豐度的慢性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)與脂質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)異常的過(guò)

6、度沉積及代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的部分我們進(jìn)一步通過(guò)建立C57BL/6J小鼠炎癥模型，觀察炎癥對(duì)小鼠肝臟組織FAT/CD36的表達(dá)及脂質(zhì)積聚程度的影響以及肝臟組織的損傷情況。
　　 方法:將小鼠分為四個(gè)組:普通飲食組（N組）、普通飲食+炎癥組(NC組)、高脂飲食組（H組）和高脂飲食+炎癥組（HC組）。普通飲食組予普通小鼠飼料，高脂飲食組予西方飼料（60％能量來(lái)源于脂肪），炎癥組予10％酪蛋白0.5ml隔日皮下注

7、射，非炎癥組予生理鹽水0.5ml隔日皮下注射作為對(duì)照。14周后處死小鼠并收集血清和組織樣本，采用ELISA法測(cè)定血清中淀粉樣蛋白A(SAA)和TNF-α以及游離脂肪酸(FFA)的含量，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)肝臟組織中TNF-α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的mRNA表達(dá)情況，以觀察炎癥模型是否成功建立。然后用Western blot和免疫組化的方法觀察小鼠肝臟組織中FAT/CD36的蛋白表達(dá)情況，用油紅O染色的方

8、法觀察組織內(nèi)脂滴形成的情況，再分別用酶法和ELISA法檢測(cè)組織TG和FFA的含量。然后進(jìn)一步檢測(cè)肝臟組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)以及H2O2和丙二醛(MDA)的含量。
　　 結(jié)果:(1)普通飲食或高脂飲食聯(lián)合酪蛋白注射都可以使小鼠血清中SAA和TNF-α的含量比對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。(2)普通飲食背景下皮下注射10％酪蛋白及高脂飲食喂養(yǎng)均可以使小鼠血清FFA的含量較普通飲食組明顯升高（P＜0.05）。(3)

9、肝臟組織中，普通飲食或高脂飲食背景下，皮下注射酪蛋白14周都可以使TNF-α的mRNA的表達(dá)水平較普通飲食組明顯升高(P＜0.05)，而高脂飲食聯(lián)合皮下注射酪蛋白可以使MCP-1的mRNA表達(dá)水平較普通飲食組顯著增加(P＜0.05)。(4)普通飲食和高脂飲食的背景下，炎癥可以使肝臟組織FAT/CD36的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。(5)普通飲食和高脂飲食的背景下，炎癥可以使肝臟組織的TG的含量明顯增加（P＜0.05）;高脂飲食

10、聯(lián)合炎癥處理的情況下，肝臟組織FFA的含量比普通飲食組及高脂飲食組都是升高的(P＜0.05)，肝臟組織冰凍切片油紅O染色的結(jié)果與TG定量檢測(cè)的結(jié)果是一致的。(6)高脂飲食聯(lián)合炎癥處理情況下，肝臟組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)和H2O2的含量是比普通飲食組明顯增高的;高脂飲食組和高脂飲食聯(lián)合炎癥處理下，肝臟組織MDA的含量比普通飲食組都是明顯增加的（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:通過(guò)對(duì)C57BL/6J小鼠皮下注射10％酪

11、蛋白14周，可以使其體內(nèi)產(chǎn)生系統(tǒng)性的炎癥和局部炎癥反應(yīng)，這表明我們成功的建立了炎癥動(dòng)物模型。普通飲食+炎癥組的血清FFA的含量比普通飲食組是升高的，但是在高脂背景下，炎癥對(duì)血清FFA的增加反而不明顯。我們推斷，在高脂飲食聯(lián)合炎癥處理的情況下，小鼠體內(nèi)的脂代謝發(fā)生嚴(yán)重紊亂，脂質(zhì)在肝臟等非脂肪組織異常的過(guò)度沉積，從而導(dǎo)致血清FFA反而升高不明顯。低豐度的慢性系統(tǒng)性炎癥能夠通過(guò)影響小鼠的肝臟組織FAT/CD36的表達(dá)從而加重肝臟組織異常的脂質(zhì)