人參皂苷Rg1通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，具有分泌細(xì)胞因子、呈遞抗原及吞噬病原體等多種功能。研究顯示黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)是帕金森病（Parkinson's Disease，PD）主要的病理改變部位，黑質(zhì)致密帶（substantia nigrapar compacta，SNpc）多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)非常敏感。尸檢結(jié)果顯示 PD患者的黑質(zhì)含有大量的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，提示免疫炎癥在PD的

2、發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。因此通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)中腦黑質(zhì) DA能神經(jīng)元成為PD治療的一種新策略。人參皂苷Rg1是我國(guó)傳統(tǒng)中藥人參的主要活性成分，具有多種生理及藥理作用，特別是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Rg1具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，但Rg1是通過(guò)何種機(jī)制作用于小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮其抗炎作用，目前尚不清楚。Rg1具有類(lèi)固醇激素樣的甾體骨架結(jié)構(gòu)，本課題組及其他研究小組的研究結(jié)果均揭示Rg1可通過(guò)類(lèi)雌激素樣和類(lèi)糖皮質(zhì)激素樣的特性

3、，發(fā)揮其生物學(xué)作用。研究顯示Rg1是糖皮質(zhì)激素受體（GR）的功能性配體，可激活GR。GR屬于核受體超家族，研究結(jié)果顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞中GR與其配體結(jié)合后激活，可通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，發(fā)揮其對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用。因此本研究第一部分采用SN微量注射脂多糖（LPS）制備去卵巢（OVX）PD炎癥大鼠模型，探討人參皂苷Rg1是否能夠通過(guò)GR抑制膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，保護(hù)中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元。雌激素受體（ER）也是核受體超家族中的一員，其基

4、因組作用是通過(guò)經(jīng)典的核受體ER和ER來(lái)介導(dǎo)的。本研究在LPS制備的PD炎癥大鼠模型上，采用腹腔注射阿撲嗎啡（APO）誘導(dǎo)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)大鼠紋狀體（Str）內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物高香草酸（HVA）和二羥基苯乙酸（DOPAC）的含量變化，免疫組織化學(xué)法及免疫熒光觀察黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況，硝酸還原酶法（Gress）檢測(cè)黑質(zhì)內(nèi)NO含量的變化，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

5、觀察黑質(zhì)內(nèi)炎癥介質(zhì)的含量及基因表達(dá)的變化，免疫印跡技術(shù)（western-blot）觀察黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、GR及炎癥相關(guān)信號(hào)通路中各種蛋白表達(dá)及磷酸化的變化。
　　本研究表明：⑴腹腔注射APO可成功誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)行為，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為9.30圈/分鐘（P<0.001）。給予Rgl（10mg/kg，i.p.）處理之后，其旋轉(zhuǎn)行為明顯改善，約4.64圈/分鐘，較 LPS組明顯降低（P<0.01

6、），此作用可被 GR阻斷劑 RU486所阻斷（P<0.001）。LPS與RU486共處理對(duì)大鼠旋轉(zhuǎn)行為沒(méi)有影響。⑵高效液相結(jié)果顯示，LPS模型組患側(cè)Str內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量較對(duì)照組明顯下降，分別降低了（72％、64%和70%）（P<0.001）；Rgl處理組患側(cè)Str內(nèi)DA、DOPAC和HVA的含量較LPS組均明顯增加（P<0.05），且此作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷（P<0.05）。⑶黑質(zhì)單側(cè)注射LPS導(dǎo)

7、致患側(cè)SN致密帶TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較健側(cè)明顯降低，存活率是健側(cè)的36.7%?；紓?cè)黑質(zhì) TH蛋白表達(dá)亦較對(duì)照組明顯減少（P<0.001）；給予Rgl處理后，可明顯拮抗LPS誘導(dǎo)的TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量及蛋白表達(dá)的下降（P<0.05），此保護(hù)作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷（P<0.05）。⑷免疫組化結(jié)果證實(shí)LPS模型組患側(cè)黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多并過(guò)度激活，給予Rgl處理后，患側(cè)黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及活化程度受到明顯抑制，

8、此抑制作用亦可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑸LPS模型組患側(cè)黑質(zhì)炎癥介質(zhì)NO、TNF-?及IL-1β的分泌量明顯高于對(duì)照組（P<0.001），Rgl處理組患側(cè)黑質(zhì)內(nèi)NO、TNF-α及IL-1β的含量較LPS組患側(cè)明顯減少（P<0.01），此抑制作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑹LPS模型組患側(cè)與對(duì)照組相比，SN區(qū)MAPKs（ERK、JNK、P38）及I?B蛋白的磷酸化水平明顯增加（P<0.01），給予Rgl處理后，可拮抗LPS誘導(dǎo)

9、的MAPKS及I?B蛋白的磷酸化水平的增加（P<0.01），此抑制作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑺LPS模型組患側(cè) SN區(qū) GR蛋白表達(dá)量較對(duì)照組有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Rg1處理組患側(cè)SN區(qū)GR蛋白表達(dá)量較LPS組明顯升高（P<0.05），此作用可被GR阻斷劑RU486所阻斷。⑻Rgl或G1可明顯改善APO誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為（P<0.001），此作用可被GPER阻斷劑G15或IGF-IR阻斷劑JB-1所阻斷。⑼

10、Rgl或G1能夠明顯拮抗LPS誘導(dǎo)的患側(cè)Str內(nèi)DA、DOPAC和HVA含量的下降（P<0.05），G15或JB-1與Rg1共處理，能夠明顯抑制Rg1的保護(hù)作用。⑽Rgl或G1能夠拮抗LPS誘導(dǎo)的SN致密帶TH免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量及蛋白表達(dá)的下降（P<0.01），此作用亦可被G15或JB-1所阻斷。⑾免疫熒光結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的SN區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，可以被Rg1或G1所拮抗。G15或JB-1與 Rg1共處理，能夠明顯抑制 Rg1的

11、抗炎作用。同時(shí)，LPS模型組SN區(qū)致密帶星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，Rg1或G1處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較LPS組明顯增加，此作用可以被G15或JB-1所阻斷。⑿LPS誘導(dǎo)的黑質(zhì)內(nèi)促炎酶（iNOS和COX-2）和炎性因子（TNF-?及IL-1β）的蛋白和基因表達(dá)的增加，亦可被Rg1或G1所拮抗（P<0.05）。G15或JB-1與Rg1共處理，能夠明顯抑制Rg1的抗炎作用。⒀Rg1或G1能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的黑質(zhì)區(qū)炎癥信號(hào)通路（MAPK