缺氧環(huán)境下IDH1突變型腫瘤細(xì)胞通過IDH2代償性表達上調(diào)參與細(xì)胞增殖.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的原發(fā)性腫瘤,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)根據(jù)臨床以及組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將其分為Ⅰ-Ⅳ級。多數(shù)膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長,其高復(fù)發(fā)率、高致殘率以及高死亡率嚴(yán)重威脅著人類健康,近年來針對膠質(zhì)瘤的治療技術(shù)雖有很大程度的提高,但療效并不十分理想。2008年,Parsons等通過高通量表達分析研究,首次發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中約有12%發(fā)生了異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate d

2、ehydrogenase1,IDH1)的基因突變,隨后,更多學(xué)者進一步的研究發(fā)現(xiàn)IDH1/2突變作為預(yù)后良好的標(biāo)志普遍存在于Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤以及繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。后續(xù)越來越多的研究表明IDH1/2突變在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。
  IDH1和IDH2是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosophate acid,NADP+)依賴型同型二聚體酶,催化異檸檬酸

3、(Isocitrate,ICT)氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate,α-KG)、還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和二氧化碳,二者所催化的上述反應(yīng)為可逆反應(yīng)。IDH1存在于細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中,其代謝產(chǎn)物α-KG對于維持細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)大量雙加氧酶的活性是必需的,其另一代謝產(chǎn)物NADPH既為脂質(zhì)生物合成提供關(guān)鍵的還原

4、當(dāng)量,同時也是極其重要的抗氧化劑,用以保護細(xì)胞免受氧化損傷。
  IDH1/2突變導(dǎo)致其催化ICT氧化脫羧生成α-KG能力降低,同時獲得還原α-KG生成2-HG這一新的功能,最終引起2-HG在細(xì)胞內(nèi)大量累積,而2-HG作為致癌代謝產(chǎn)物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。這些致癌機制包括缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)致腫瘤學(xué)說、基因組高甲基化學(xué)說,以及最近發(fā)現(xiàn)2-HG可引

5、起絕緣子功能障礙,通過破壞染色體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及異常調(diào)節(jié)誘導(dǎo)癌基因表達,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
  脂類作為人體組織的重要組成成分,在供給能量、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。在常氧環(huán)境下,脂質(zhì)合成所需要的原材料主要由葡萄糖供給,葡萄糖進入線粒體在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化作用下生成乙酰輔酶A(Acetyl–CoA,AcCoA),后者經(jīng)過檸檬酸-丙酮酸循環(huán)進入細(xì)胞質(zhì),在脂肪酸合酶等的催化作用下生成脂肪酸。然而在低氧環(huán)境下,由于丙酮酸脫氫酶復(fù)

6、合體活性受到HIF-1α的抑制,導(dǎo)致糖酵解生成的丙酮酸不能夠進入線粒體中生成AcCoA。因此,腫瘤組織細(xì)胞為了適應(yīng)低氧環(huán)境所造成的不利影響,其必須通過其它途徑來代償合成足夠的AcCoA來維持脂質(zhì)的合成。和葡萄糖一樣,谷氨酰胺可以作為能源和供碳以及供氮前體參與到細(xì)胞的物質(zhì)合成代謝。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下生成谷氨酸,后者進入線粒體,在谷氨酸脫氫酶的作用下進一步轉(zhuǎn)化生成α-KG,生成的α-KG一方面可以延著三羧酸循環(huán)方向參與到線粒體能量

7、代謝;另一方面亦可在IDH1/2的催化作用下逆向生成異檸檬酸、檸檬酸,二者出線粒體進入到細(xì)胞質(zhì)中,進一步裂解生成 AcCoA參與到脂質(zhì)合成。由此,在缺氧條件下腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)而依賴于IDH1/2途徑介導(dǎo)的脂質(zhì)合成以滿足細(xì)胞增殖需要。
  由于 IDH1突變不僅抑制了氧化脫羧反應(yīng),同時亦抑制了還原羧化反應(yīng),導(dǎo)致IDH1突變型腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下表現(xiàn)為脂質(zhì)合成缺陷細(xì)胞,其細(xì)胞增殖活性降低。據(jù)此我們提出如下科學(xué)假說:IDH1和IDH2共同參與

8、了低氧條件細(xì)胞的脂質(zhì)合成,IDH1 R132H突變型腫瘤細(xì)胞通過高表達IDH2來補償因IDH1突變導(dǎo)致的不利影響。
  本實驗中我們采用三組實驗細(xì)胞作為研究對象。首先,通過組織塊培養(yǎng)法,成功培養(yǎng)了IDH1 WT和IDH1+/ R132H突變型星形膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞株;第二,采用病毒感染以及藥物篩選成功建立了穩(wěn)定過表達IDH WT和IDH1 R132H U251細(xì)胞株;第三為IDH1 WT和IDH1+/R132H HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞

9、株,該細(xì)胞株由同源重組技術(shù)構(gòu)建,其突變類型以及表達量均可以很好的模擬病人來源膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
  首先,采用細(xì)胞增殖毒性檢測實試(cell counting kit-8,CCK-8)比較了常氧和缺氧情況下 IDH1野生型和 R132H突變型細(xì)胞的增殖活性,證實在低氧環(huán)境下 IDH1 R132H突變型腫瘤細(xì)胞增殖活性降低。其次,采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)對比檢測了上述細(xì)胞中IDH2的蛋白水平,首次證實IDH1

10、R132H突變型腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下IDH2代償性升高。最后,我們采用小干擾RNA技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi) IDH2蛋白表達,觀察對IDH1 R132H突變型腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響,結(jié)果表明沉默IDH2的表達水平后可以明顯抑制IDH1 R132H突變型腫瘤細(xì)細(xì)胞的增殖活性。
  本研究首次提出缺氧條件下IDH1 R132H突變型腫瘤細(xì)胞通過IDH2的高表達來維持細(xì)胞惡性增殖,提示IDH2可以作為一個潛在的抗IDH1 R132H突變型腫瘤的治

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